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Multidrug-resistant Proteus mirabilis isolates carrying blaOXA-1 and blandm-1 from wildlife in China:increasing public health risk

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Integrative Zoology 2021年第6期16卷 798-809页

作者： Qian KANG Xue WANG Jianan ZHAO Zhihui LIU Fang JI Han CHANG Jianchun YANG Shijia HU Ting JIA Xiaojia WANG Jiagui TANG Guoying DONG Guocheng HU Jing WANG Yanyu ZHANG Jianhua QIN Chengmin WANG Guangdong Key Laboratory of Animal Conservation and Resource Utilization Guangdong Public Laboratory of Wild Animal Conservation and UtilizationInstitute of ZoologyGuangdong Academy of ScienceGuangzhouGuangdongChina College of Veterinary Medicine Agricultural University of HebeiBaodingHebeiChina Institute of zoology Chinese Academy of SciencesBeijingChina Beijing Key Laboratory of Captive Wildlife Technologies Beijing ZooBeijingChina Chongqing Zoo Chongqing College of Global Change and Earth System Science Beijing Normal UniversityBeijingChina South China Institute of Environmental Sciences Ministry of Ecology and EnvironmentGuangzhouGuangdongChina Department of Infectious Diseases Hangzhou Center of Disease Control and PreventionZhejiangChina Beijing Key Laboratory of Blood Safety and Supply Technologies Institute of Health Service and Transfusion MedicineBeijingChina

The emergence of multidrug resistance(MDR)in Proteus mirabilis clinical isolates is a growing public health concern and has serious implications for wildlife.What is the role of wildlife has been become one of the hot issues in disseminating antimicrobial resistance.Here,54 P.mirabilis isolates from 12 different species were identified.Among them,25 isolates were determined to be MDR by profile of antimicrobial susceptibility;10 MDR P.mirabilis isolates were subjected to comparative genomic analysis by whole genome sequencing.Comprehensive analysis showed that chromosome of P.mirabilis isolates mainly carries multidrug-resistance complex elements harboring resistance to carbapenem genes blaOXA-1,blandm-1,and blaTEM-1.Class I integron is the insertion hotspot of IS26;it can be inserted into type I integron at different sites,thus forming a variety of multiple drug resistance decision sites.At the same time,Tn21,Tn7,and SXT/R391 mobile elements cause widespread spread of these drug resistance genes.In conclusion,P.mirabilis isolates from wildlife showed higher resistance to commonly used clinic drugs comparing to those from human.Therefore,wild animals carrying MDR clinical isolates should be paid attention to by the public health.

关键词： blandm-1 blaOXA-1 multidrug-resistant Proteus mirabilis wildlife

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blandm-1基因敲除对阴沟肠杆菌毒力的影响

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吉林大学学报（医学版） 2022年第6期48卷 1389-1394页

作者：代鹏飞杨恺杜艳刘淑敏昆明医科大学第一附属医院医学检验科云南省检验医学重点实验室云南省医学检验临床医学研究中心云南昆明650032

目的:比较bla NDM-1基因敲除前后阴沟肠杆菌毒力的变化,阐明bla NDM-1基因对其毒力的影响。方法:将携带bla NDM-1基因的阴沟肠杆菌分为携带耐药基因bla NDM-1的阴沟肠杆菌T2(T2组)、阴沟肠杆菌T2 bla NDM-1基因敲除株(ΔT2组)和阴沟肠杆... 详细信息

目的:比较bla NDM-1基因敲除前后阴沟肠杆菌毒力的变化,阐明bla NDM-1基因对其毒力的影响。方法:将携带bla NDM-1基因的阴沟肠杆菌分为携带耐药基因bla NDM-1的阴沟肠杆菌T2(T2组)、阴沟肠杆菌T2 bla NDM-1基因敲除株(ΔT2组)和阴沟肠杆菌ATCC13047 (ST组)。检测各组质粒稳定性、各组阴沟肠杆菌的菌落运动直径、生物膜吸光度(A)值、黏附细菌量、黏附率及侵袭黏附比。结果:传代200次后,T2组阴沟肠杆菌仍携带bla NDM-1基因,ΔT2和ATCC13047组阴沟肠杆菌不携带bla NDM-1基因;T2组阴沟肠杆菌仅携带碳青霉烯类耐药基因bla NDM-1,其他碳青霉烯类耐药基因bla KPC-2、bla IMP-4、bla VIM-1和bla OXA-48均为阴性;ΔT2和ST组所检测的5种碳青霉烯类耐药基因均为阴性,T2与ΔT2组阴沟肠杆菌携带相同的毒力基因clp B、icmf和acr A。T2组菌落运动直径小于ΔT2和ST组(P0.05)。与T2组比较,ΔT2组黏附细菌量降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。共培养24 h后,T2组和ΔT2组RAW264.7细胞的黏附率和侵袭黏附比低于ST组(P1基因未明显增加阴沟肠杆菌的毒力。

关键词：阴沟肠杆菌 blandm-1 基因敲除毒力耐药

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ST11肺炎克雷伯菌QL5株携带的质粒pQL5-NDM-KPC的研究

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中国实验诊断学 2024年第4期28卷 401-404页

作者：马超越王笑刘真真贾楠朱元祺青岛大学附属医院山东青岛266003 枣庄市山亭区人民医院山东枣庄277200

目的探讨肺炎克雷伯菌QL5株携带编码碳青霉烯酶基因的质粒及其特性。方法基于二代Illumina和三代Nanopore测序技术平台获得菌株的基因组和质粒序列,然后用一系列软件分析菌株的生物学信息。S1核酸酶切脉冲场凝胶电泳、质粒液相接合试验... 详细信息

目的探讨肺炎克雷伯菌QL5株携带编码碳青霉烯酶基因的质粒及其特性。方法基于二代Illumina和三代Nanopore测序技术平台获得菌株的基因组和质粒序列,然后用一系列软件分析菌株的生物学信息。S1核酸酶切脉冲场凝胶电泳、质粒液相接合试验和稳定性试验检测菌株携带的质粒特性。结果生信分析显示:肺炎克雷伯菌QL5株携带的bla_(NDM-1)和bla_(KPC-2)基因位于同一个IncC/IncFII(PHN7A8)/IncR杂合质粒上(命名为pQL5-NDM-KPC);QL5株携带的pQL5-NDM-KPC可发生bla_(NDM-1)基因所在区域的片段丢失。结论经检索,携带bla_(NDM-1)和bla_(KPC-2)基因位于同一个IncC/IncFII(PHN7A8)/IncR杂合质粒pQL5-NDM-KPC(GenBank序列号:OR253888)上,为国内外首次报道。

关键词：肺炎克雷伯菌 blaKPC-2 blandm-1 质粒

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Detection of blandm-1 and Genetic Relatedness in Clinical Isolates of Escherichia coli Producing Extended Spectrum β-Lactamase from Tertiary Care Centres in South India

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Advances in Microbiology 2016年第3期6卷 125-132页

作者： Nithya Narayanan Manju Suresh Jayasree Pullampara Rajamma Manish Kumar Panickassery Ramakrishnan Department of Biotechnology University of Calicut Malappuram India

Background: Extended spectrum β-lactamases (ESBL) producing E. coli co-producing other β-lactamases and exhibiting co-resistance to different antibiotic classes continue to emerge as a threat to clinical field. This study aimed to analyze the co-production of New Delhi metallo-β-lactamase-1 (blandm-1) in ESBL producing plasmid-bearing clinical isolates collected from two tertiary care centres in Kerala, South India, and to understand their genetic relatedness. Methods: Antibiotic resistance phenotypes of 44 clinical isolates were determined by disc-diffusion method. Plasmid-bearing isolates, detected by the alkaline-lysis method, which also tested positive for ESBL production, were screened for the presence of blandm-1 by polymerase chain reaction. Plasmid, random amplified polymorphic DNA profiles and blandm-1 sequence-based phylogenetic tree were analyzed to understand the genotypic similarities among the isolates. Results: Beta-lactam antibiotics, quinolones, cephalosporins, used in this study, and AZM were found to be ineffective against the isolates as significantly high number of isolates were resistant to these antibiotics (P 1). Plasmid bearing isolates constituted 57% (n = 25), all of which were found to be ESBL producers. blandm-1 amplicons were noticed in four (16%) isolates and these DNA sequences showed homology between them and with similar sequences reported from other countries like Japan and Korea. Plasmid and RAPD profiles demonstrated that most of the isolates, including those harbouring blandm-1 shared genetic similarities as well as an apparent geographical distinctiveness. Conclusion: The predominance of ESBL production and the occurrence of blandm-1 in plasmid-bearing isolates observed in our study corroborate the worldwide drug-resistance scenario. This study thus warrants the need for constant surveillance in the face of sparse information available in Kerala State on the emerging drug resistance in clinical bacteria.

关键词： ESBL blandm-1 Plasmids E. coli

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同时携带blandm-1和blaKPC-2基因肺炎克雷伯菌的研究

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中国实验诊断学 2023年第3期27卷 279-283页

作者：王笑王晓慧姜美妍伦立民朱元祺青岛大学医学部检验系山东青岛266071 青岛大学附属医院山东青岛266003 淄博市张店区人民医院山东淄博266034

目的探讨某医院儿科分离的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药的机制和菌株的同源性。方法2021年6月~2021年12月在某医院儿科住院患儿中分离出8株对碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌。细菌的鉴定和药敏采用VITEK 2系统。基于Illumina和Nanopore... 详细信息

目的探讨某医院儿科分离的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药的机制和菌株的同源性。方法2021年6月~2021年12月在某医院儿科住院患儿中分离出8株对碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌。细菌的鉴定和药敏采用VITEK 2系统。基于Illumina和Nanopore测序平台获得菌株的基因组和质粒序列,然后用软件分析菌株的生物学信息。Xba I酶切脉冲场凝胶电泳(PFGE)、S1核酸酶切脉冲场凝胶电泳(S1-PFGE)和质粒的液相接合试验分别检测菌株的同源性和携带的质粒。结果这8株肺炎克雷伯菌都携带blandm-1和blaKPC-2及其他的耐药基因,与呈现的多重耐药表型相符合。依据Tenover规则,这8株菌的PFGE属于相同的克隆群,且多位点序列都属于ST11型。S1-PFGE和测序结果都显示QD1株携带三个质粒,分别命名为P1(携带blandm-1)、P2和P3(携带blaKPC-2)。另外,液相接合显示QD1株携带的P1质粒(携带blandm-1)可水平传递到大肠埃希菌J53Azi^(R)。结论研究表明这些菌株对碳青霉烯类的耐药是因为携带了blandm-1和blaKPC-2基因。经检索,同时携带blandm-1和blaKPC-2基因的ST11型肺炎克雷伯菌在儿科患者中的暴发流行为国内外首次报道。

关键词：肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶 blaKPC-2 blandm-1 基因

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耐药基因blandm-1和mcr-1在肠道细菌中的研究进展

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中国人兽共患病学报 2020年第8期36卷 660-664页

作者：吕东月汪照国王鑫青岛大学公共卫生学院青岛266021 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所北京102206

随着抗菌药物的频繁使用,细菌耐药性已成为21世纪全球公共卫生共同关注的问题之一。全球相继发现碳青霉烯类抗生素耐药基因blandm-1和多黏菌素耐药基因mcr-1,两种耐药基因均能通过质粒水平转移,对人类造成严重威胁。本文就blandm-1基因... 详细信息

随着抗菌药物的频繁使用,细菌耐药性已成为21世纪全球公共卫生共同关注的问题之一。全球相继发现碳青霉烯类抗生素耐药基因blandm-1和多黏菌素耐药基因mcr-1,两种耐药基因均能通过质粒水平转移,对人类造成严重威胁。本文就blandm-1基因和mcr-1基因的发现、流行、耐药机制及检测方法等方面进行综述,以期能为严格控制抗生素的使用提供理论依据。

关键词：抗菌素 blandm-1 mcr-1 耐药性

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耐药基因blandm-1对阴沟肠杆菌生物学特性和致病性的影响

耐药基因blaNDM-1对阴沟肠杆菌生物学特性和致病性的影响

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作者：代鹏飞昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]阴沟肠杆菌是一种机会致病菌,是肠道正常菌群中的一种,可引起多种肠道外感染。耐药基因blandm-1可编码新德里金属β内酰胺酶1,它是阴沟肠杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制之一。本研究的目的是阐明耐药基因blandm-1对阴沟... 详细信息

[目的]阴沟肠杆菌是一种机会致病菌,是肠道正常菌群中的一种,可引起多种肠道外感染。耐药基因blandm-1可编码新德里金属β内酰胺酶1,它是阴沟肠杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制之一。本研究的目的是阐明耐药基因blandm-1对阴沟肠杆菌生物学特性和致病性的影响,为携带blandm-1的碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌的预防控制和临床诊疗提供依据。[方法]1.质粒稳定性实验:将前期研究筛选得到的携带耐药基因blandm-1的阴沟肠杆菌T2(NDM-1组)、阴沟肠杆菌T2 blandm-1基因敲除株(△NDM-1组)及阴沟肠杆菌ATCC13047(ST组)传代200次后,首先进行抗菌药物敏感实验,接着检测是否携带blandm-1基因,据此判断传代中携带blandm-1基因的质粒是否会出现丢失。2.耐药基因blandm-1对阴沟肠杆菌生物学特性和致病性研究:首先研究前期研究筛选得到的携带耐药基因blandm-1的阴沟肠杆菌T2、阴沟肠杆菌T2 blandm-1基因敲除株及阴沟肠杆菌ATCC13047来探讨耐药基因blandm-1对它们生物学特性的影响,接着在细胞和动物水平研究耐药基因blandm-1对阴沟肠杆菌致病性的影响。2.1阴沟肠杆菌的生物学特性研究:包括耐药和毒力基因的扩增、运动性实验、生物膜形成能力和血清抗性实验。实验组包括携带耐药基因blandm-1的阴沟肠杆菌T2、阴沟肠杆菌T2 blandm-1基因敲除株及阴沟肠杆菌ATCC13047,PCR扩增三株阴沟肠杆菌携带的常见的碳青霉烯类耐药基因和毒力基因,并测序验证。2.2细胞实验:黏附侵袭实验、LDH浓度的测定。2.3动物实验:在一周内腹膜炎ICR小鼠的死亡数量,腹膜炎小鼠肝脏、肺脏和小肠组织的病理特征,脾脏带菌量,肝脏、肺脏和脾脏产生的细胞因子IL-1β、IL-6 及 TNF-α的含量。3.统计学分析:采用IBM SPSS 20.0统计学软件包进行数据分析。[结果]1.质粒稳定性实验:传代200次后,阴沟肠杆菌T2仍携带blandm-1基因,阴沟肠杆菌T2 blandm-1基因敲除株不携带blandm-1基因,阴沟肠杆菌ATCC13047不携带blandm-1基因,表明携带blandm-1基因的质粒未丢失,稳定存在。2.耐药基因blandm-1对阴沟肠杆菌生物学特性和致病性影响的研究结果2.1阴沟肠杆菌的生物学特性研究:①耐药基因和毒力基因的检测:携带耐药基因blandm-1的阴沟肠杆菌T2仅携带碳青霉烯类耐药基因blandm-1,其他碳青霉烯类耐药基因blaKPC-2、blaIMP-4、blaVIM-1、blaOXA-48均为阴性,阴沟肠杆菌T2 blandm-1基因敲除株和阴沟肠杆菌ATCC13047所检测的五种碳青霉烯类耐药基因均为阴性;阴沟肠杆菌T2与阴沟肠杆菌T2 blandm-1基因敲除株有相同的毒力基因clpB、icmf、acrA,其他毒力基因VasD/Lip、wcam、fimH、mrkD、mrkB及csgB均为阴性,阴沟肠杆菌ATCC13047中毒力基因clpB、icmf、acrA、VasD/Lip和wcam为阳性,未检测出fimH、mrkD、mrkB及csgB。②携带耐药基因blandm-1的阴沟肠杆菌T2的运动直径为0.785±0.127cm,阴沟肠杆菌T2 blandm-1耐药基因敲除株的运动直径为1.445±0.255cm,阴沟肠杆菌ATCC13047的运动直径为1.370±0.270cm,阴沟肠杆菌T2 blandm-1耐药基因敲除株与阴沟肠杆菌ATCC13047的运动直径高于携带blandm-1耐药基因的阴沟肠杆菌T2,差异具有统计学意义。③在三个时间点24h、48h、72h,携带blandm-1耐药基因的阴沟肠杆菌T2与阴沟肠杆菌T2 blandm-1耐药基因敲除株的生物膜吸光度值无统计学差异,它们均高于阴性对照组的吸光度值,但比阴沟肠杆菌ATCC13047的吸光度值低。④血清抗性实验结果显示,携带耐药基因blandm-1的阴沟肠杆菌T2的存活率为0.624±0.112,阴沟肠杆菌T2 blandm-1耐药基因敲除株的存活率为0.476±0.143,阴沟肠杆菌ATCC13047的存活率为0.533±0.166,三组未见统计学差异。2.2细胞实验:①阴沟肠杆菌与RAW264.7共同孵育3h后结果显示,黏附实验结果显示阴沟肠杆菌T2 blandm-1耐药基因敲除株与阴沟肠杆菌ATCC13047存在统计学差异(P=0.019),其他各组间均无统计学差异,侵袭实验显示三组均未见统计学差异;共同孵育24h后,黏附实验与侵袭实验均显示阴沟肠杆菌T2 blandm-1耐药基因敲除株与阴沟肠杆菌ATCC13047存在统计学差异,携带blandm-1耐药基因的阴沟肠杆菌T2与阴沟肠杆菌ATCC13047存在统计学差异,携带blandm-1耐药基因的阴

关键词： blandm-1 阴沟肠杆菌毒力致病性耐药生物学特性

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肠杆菌临床株blandm-1基因的检测及其同源性研究

肠杆菌临床株blaNDM-1基因的检测及其同源性研究

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作者：赵辉青岛大学

学位级别：硕士

目的探讨耐碳青霉烯类抗菌药物的阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌临床分离株的耐药机制,为预防和控制医院感染的流行、暴发提供指导。方法收集2013年9月到2015年6月从临床标本中分离的对亚胺培南和美罗培南耐药的10株阴沟肠杆菌(YG10)和7株肺... 详细信息

目的探讨耐碳青霉烯类抗菌药物的阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌临床分离株的耐药机制,为预防和控制医院感染的流行、暴发提供指导。方法收集2013年9月到2015年6月从临床标本中分离的对亚胺培南和美罗培南耐药的10株阴沟肠杆菌(YG10)和7株肺炎克雷伯菌(FK1);法国生物梅里埃公司VITEK-2全自动细菌分析系统对菌株进行鉴定和药敏;亚胺培南/EDTA E-test条筛选产金属酶菌株;聚合酶链反应(PCR)扩增和测序确认菌株携带的碳青霉烯酶、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)、Amp C酶和喹诺酮类耐药及磷霉素耐药相关基因;脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)进行菌株的同源性检测;质粒接合试验和Southern杂交分析质粒转移能力和其特性。结果17株菌金属酶E-test试验均呈阳性,且都扩增出blandm-1基因及其他耐药基因,包括CMY-6,DHA-1,SHV-12,ACT-35,TEM-1,qnr B,qnr S1和fos A。经产物测序比对,7株肺炎克雷伯菌多位点序列分型是ST1224(5株)和ST478(2株)。这5株ST1224肺炎克雷伯菌脉冲场凝胶电泳条带数目和位置完全一致,而另两株ST478型的条带数和位置也几乎一致,表明医院存在携带bla基因的ST1224和ST478肺炎克雷伯菌两个克隆的传播流行。10株阴沟肠杆菌脉冲场凝胶电泳显示:YG1、YG8和YG9菌株的电泳条带数目和位置基本一致,之间相差不超过三条带,其中YG1条带完全一样,按Tenover规则判定这五株菌是主要暴发株,而YG6、YG8和YG9是与暴发株密切相关;YG7和YG10两株各不相同,与前8株也不存在同源性。阴沟肠杆菌多位点序列分型表明YG1、YG8和YG9菌株是ST177型,而YG7和YG10两株分别为ST51和ST418型,这与脉冲场凝胶电泳的结果相一致。17株菌均接合成功,表明携带bla的质粒可以通过接合的方式发生转移。10株不同医院来源的阴沟肠杆菌都携带含有bla的质粒,大小约50000bp,分型均为Inc FⅡ;7株肺炎克雷伯菌携带含有bla的质粒,大小约140000bp,且质粒分型均为Inc A/C。结论研究结果表明,医院中既存在携带bla基因的ST1224型肺炎克雷伯菌引起的新生儿医院感染暴发又存在携带bla基因的ST177阴沟肠杆菌引起的医院感染暴发。经检索,上述结果在国内外均未有报道。因此,为了预防和控制产bla耐药菌的暴发和流行,应加强对碳青霉烯类耐药菌的监测。

关键词：肠杆菌 blandm-1 脉冲场凝胶电泳多位点序列分型

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携带blandm-1基因肠杆菌科细菌的耐药基因及其同源性研究

携带blaNDM-1基因肠杆菌科细菌的耐药基因及其同源性研究

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作者：徐茶青岛大学

学位级别：硕士

目的探讨临床分离的对碳青霉烯酶类抗菌药物耐药的肠杆菌科细菌的耐药表型、基因型和菌株之间的同源性,为医院感染的控制和预防提供指导。方法收集临床分离的对碳青霉烯酶类抗菌药物耐药的3株肺炎克雷伯菌和16株雷极普罗威登菌,共19株;... 详细信息

目的探讨临床分离的对碳青霉烯酶类抗菌药物耐药的肠杆菌科细菌的耐药表型、基因型和菌株之间的同源性,为医院感染的控制和预防提供指导。方法收集临床分离的对碳青霉烯酶类抗菌药物耐药的3株肺炎克雷伯菌和16株雷极普罗威登菌,共19株;采用法国梅里埃Vitek 2 Compact系统对细菌进行鉴定和药敏;改良Hodge试验和亚胺培南-EDTA E-test条法(金属酶,MBL)初步筛查菌株是否产金属酶;聚合酶链反应检测菌株是否携带产碳青霉烯酶基因、超广谱β-内酰胺酶基因、Amp C酶基因、喹诺酮耐药相关基因和磷霉素耐药基因(fos A3),并通过测序确定基因型;多位点序列分型(MLST)和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株的同源性;质粒接合和Southern杂交试验分析携带bla质粒的特性。结果19株菌Hodge试验和金属酶E条试验均呈阳性,且均携带多个耐药基因,呈现多重耐药。3株肺炎克雷伯菌均携带bla、bla TEM-1、fos A3、oqx A和oqx B基因,而接合子携带bla、bla TEM-1和fos A3基因。16株雷极普罗威登菌中,7株接合成功的原代菌和接合子均携带bla、aac(6′)-Ⅰb和bla TEM-116基因,而另外接合试验不成功的9株仅携带bla、和bla TEM-116基因。脉冲场凝胶电泳显示:3株肺炎克雷伯菌的带型完全一致,属于同一克隆,且MLST分型都是ST22;16株雷极普罗威登菌中,11株菌条带数目和位置完全一致,与另外5株菌的差异只有1个条带,提示院内存在克隆的流行。质粒接合、分型和Southern杂交试验结果显示肺炎克雷伯菌和雷极普罗威登菌携带bla基因的质粒可以通过接合方式转移到受体菌(E.coli J53AziR),两者的质粒大小分别是220 000bp和130 000bp,且质粒分型都属于Inc A/C型。结论经检索,同时携带bla、bla TEM-1、fos A3、oqx A和oqx B基因的ST22型肺炎克雷伯菌和携带bla和blaTEM-116基因的雷极普罗威登菌在国内外均未有报道。因此,应该加强对碳青霉烯类耐药菌的监测,预防和控制产NDM耐药菌的爆发和流行。

关键词： blandm-1 肠杆菌耐药同源性

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鲍曼不动杆菌blandm-1基因分子遗传学分析及表达与活性研究

鲍曼不动杆菌blaNDM-1基因分子遗传学分析及表达与活性研究

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作者：夏力亮吉林大学

学位级别：硕士

抗生素的出现和应用在动物与人类治疗疾病中发挥及其重要的作用，但是由于抗生素的大量滥用，导致了越来越多耐药菌株的出现，并且近几年出现很多新型的超级耐药细菌，增加了临床用药难度，严重危害动物和人类的健康。产生β-内酰胺酶... 详细信息

抗生素的出现和应用在动物与人类治疗疾病中发挥及其重要的作用，但是由于抗生素的大量滥用，导致了越来越多耐药菌株的出现，并且近几年出现很多新型的超级耐药细菌，增加了临床用药难度，严重危害动物和人类的健康。产生β-内酰胺酶是细菌耐药的重要机制之一，金属β-内酰胺酶(metallo-β-lactamase, MBL)是β-内酰胺酶中的一类，其活性部位为一个或多个金属离子(主要为Zn)，其具有更高的水解抗生素活性。MBLs的底物包括除了单环以外的几乎所有β-内酰胺类抗生素，使细菌对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类等药物均有耐受性，而且临床上使用的β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦等均不能抑制其活性，携带MBL基因的细菌对于公共卫生安全是一个很大的威胁。 2008年，科学家报道一种新发现的由bla基因编码的金属-β-内酰胺酶，由于首个病例在印度新德里发现，因此一些科学家把这种新发现的酶称为NDM-1(New Delhimetallo-β-lactamase)。携带该基因的细菌几乎能对所有抗生素产生抗性，该酶水解活性远高于已发现的金属β-内酰胺酶，这一发现引发世人的关注。 2010年中国首次报道了携带bla基因的阳性菌，该多重耐药鲍曼不动杆菌XM1570分离于一名肺癌病人的痰培养液中。本研究以首次报道国内携带bla不动杆菌XM1570为基础，通过全基因组测序发现染色体基因组大小约为4.1Mb和质粒pXM1大小为47.3kb，bla基因位于质粒pXM1上，bla基因与已报道序列同源性为100%。通过对bla基因上下游序列分析发现，bla基因位于Tn125转座子上，转座子大小10099bp，两端为正向的ISAba125插入序列，包含8个阅读框。与已报道的不动杆菌属中携带bla基因的Tn125具有高度同源性。通过对比不同种属中bla基因上游序列发现，存在不同移动元件(IS26,IS903,IS5)以及截短的ISAba125，这些移动元件在介导不同种属间bla基因水平传播起到重要作用。序列比对发现ISAba125上下游碱基具有GTT重复碱基，与国内报道序列结果一致。在Tn5393d中，发现了位于与ISAba125两侧相同的连续序列，在分子遗传学上分析表明ISAba125整合子与Tn5393d存在一定的关系。国外报道的转座插入到染色体上的识别位点有所不同，但是一般为3个碱基，还不能确定是否有特异性的识别位点，但据此可以推测不动杆菌属中Tn125转座子在介导的bla基因的水平可能发挥了重要作用。本研究对bla基因进行了克隆，运用生物信息学软件对NDM-1蛋白进行了初步的分析。NDM-1蛋白由270个氨基酸组成，分子质量为28487.86Da，等电点为5.89，SignalP4.1软件预测1-28位氨基酸为信号肽。BLAST比对发现NDM-1与其他亚型金属酶同源性很低，但是具有金属酶典型的活性中心。构建了两种表达载体： pET-28a::bla和pMAL-p2x::bla，诱导表达出了目的蛋白。BL21(pET-28a::bla)表达蛋白以包涵体形式存在，而Tb1(pMAL-p2x::bla)表达的重组蛋白主要存在于上清中。后续表达条件优化结果显示，在37℃、IPTG浓度为0.3mmol/l、诱导时间为8小时条件下，重组蛋白表达量最高，薄层扫描结果显示表达量占菌体蛋白的39.2%。采用亲和层析对目的蛋白进行了纯化。酶活性研究和头孢显色法发现重组蛋白MBP-NDM-1具有金属酶活性，重组蛋白对亚胺培南的动力学试验结果为Km=69.347μM/l。EDTA作为一种金属螯合剂能够螯合NDM-1蛋白活性中心的Zn，从而抑制其水解底物的活性。25μmol/L的EDTA可以抑制重组蛋白(1.068μg/mL)的酶活性。通过对所表达蛋白活性分析，为以后开发新型酶抑制剂研究奠定了基础。

关键词：鲍曼不动杆菌 blandm-1 序列分析表达酶活性

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