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bfgf基因修饰的骨髓间充质干细胞在脊髓损伤动物模型中bfgf表达的实验研究

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bFGF基因修饰的骨髓间充质干细胞在脊髓损伤动物模型中bFGF表达的...

作者：黄朱宋福建医科大学

学位级别：硕士

脊髓损伤常导致损伤平面以下感觉、运动功能不可逆、永久性丧失,给患者造成极大伤害,给家庭及社会造成极大负担。中枢神经系统(CNS)损伤后,轴突所处的微环境比轴突本身更影响其再生。细胞移植可替代丢失的神经细胞,它分泌的各种神经生... 详细信息

脊髓损伤常导致损伤平面以下感觉、运动功能不可逆、永久性丧失,给患者造成极大伤害,给家庭及社会造成极大负担。中枢神经系统(CNS)损伤后,轴突所处的微环境比轴突本身更影响其再生。细胞移植可替代丢失的神经细胞,它分泌的各种神经生长因子可促进轴突的再生,桥接神经缺损后遗留的空隙,改善CNS的轴突再生环境,为轴突的生长提供物理支架,符合联合治疗脊髓损伤理念,因此细胞移植成为目前脊髓损伤修复领域研究的热点。碱性成纤维细胞生长因子bfgf (FGF-2) (basic fibroblast growth factor)是FGF家族的成员之一,具有促血管形成、诱导胚胎发育、促进神经生长等功能,bfgf在体内分布广泛,尤其是在神经组织中含量丰富。目前已经有大量的研究证实碱性成纤维细胞生长因子对脊髓损伤(spinal cord injury SCI)的再生和修复具有重要作用,但由于急性脊髓损伤后bfgfR表达时程早于bfgf转录合成,因此限制了机体内源性bfgf发挥保护缺血损伤神经元的作用,这提示治疗脊髓损伤时需在bfgfR高表达时程提供足够bfgf。而通过局部或全身给予外源性bfgf均难以达到理想的治疗效果,本研究正是为解决这一问题而作的基础研究。将bfgf基因以质粒pcDNA3.1为载体,通过脂质体转染法导入骨髓间充质干细胞(MSCs)中,使外源bfgf基因能持续稳定高表达,将基因修饰的细胞移植到损伤的脊髓中,使其在体内合成分泌bfgf,这将可能为损伤脊髓及时提供足量bfgf,同时改善脊髓损伤局部微环境,为后续研究奠定基础。本文的研究内容主要包括以下三个部分:1、用贴壁筛选法获取高纯度的骨髓间充质干细胞;2、将pcDNA3.1-bfgf质粒通过脂质体转染法导入骨髓间充质干细胞后检测目的基因表达水平;3、将基因修饰的骨髓间充质干细胞移植到脊髓损伤动物模型中,用免疫组化方法检测基因组、空载体组、骨髓间充质干细胞组及培养基组在脊髓中bfgf的表达水平;应用RT -PCR方法检测外源基因bfgfmRNA的表达情况。本研究所取得的结果及结论:1、通过贴壁筛选法可获取高纯度的骨髓间充质干细胞。2、将pcDNA3.1-bfgf质粒通过脂质体转染法导入骨髓间充质干细胞,目的基因在细胞中能有效表达。3、将基因修饰的骨髓间充质干细胞移植到脊髓后外源性bfgf基因能即时、持续、稳定表达,极大提高bfgf的表达水平。结论:(1)通过贴壁筛选法可以获得高纯度的骨髓间充质干细胞;(2)将bfgf基因以pcDNA3.1为载体通过脂质体转染导入骨髓间充质干细胞,能使骨髓细胞在体外培养过程中表达分泌bfgf;(3)将bfgf基因与骨髓间充质干细胞移植载体相结合,具有独特的优势,能为损伤脊髓及时提供稳定高水平的bfgf。

关键词： bfgf基因骨髓间充质干细胞基因修饰脊髓损伤细胞移植

bfgf基因修饰雪旺细胞bfgf表达的实验研究

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bFGF基因修饰雪旺细胞bFGF表达的实验研究

作者：王锋福建医科大学

学位级别：硕士

碱性成纤维细胞生长因子bfgf (FGF-2) (basic fibroblast growth factor)是FGF家族的成员之一,具有促血管形成、诱导胚胎发育、促进神经生长等功能,bfgf在体内分布广泛,尤其是在神经组织中含量丰富。目前已经有大量的研究证实碱性成纤... 详细信息

碱性成纤维细胞生长因子bfgf (FGF-2) (basic fibroblast growth factor)是FGF家族的成员之一,具有促血管形成、诱导胚胎发育、促进神经生长等功能,bfgf在体内分布广泛,尤其是在神经组织中含量丰富。目前已经有大量的研究证实碱性成纤维细胞生长因子对脊髓损伤(spinal cord injury SCI)的再生和修复具有重要作用,但由于急性脊髓损伤后bfgfR表达时程早于bfgf转录合成增加,因此限制了机体内源性bfgf发挥保护缺血损伤神经元的作用,这提示治疗脊髓损伤时需在bfgfR高表达时程提供足够bfgf。而通过局部或全身给予外源性bfgf均难以达到理想的治疗效果,本研究正是为解决这一问题而作的基础研究。将bfgf基因以质粒pcDNA3.1为载体,通过脂质体转染法导入雪旺细胞(schwann cell,SC),使外源bfgf基因能持续稳定高表达,在体内合成分泌bfgf,这将可能为损伤脊髓及时提供足量bfgf、为改善脊髓损伤局部微环境奠定基础。本文的研究内容主要包括以下三个部分: 1、用混合酶消化法获取高纯度的雪旺细胞;2、PCR扩增bfgf基因片段,构建重组质粒bfgf- pcDNA3.1;3、将pcDNA3.1-bfgf质粒通过脂质体转染法导入雪旺细胞,用ELISA方法检测实验组、空载体组及空白对照组雪旺细胞培养上清中bfgf的表达水平;应用RT -PCR方法检测外源基因bfgfmRNA的表达情况。本研究所取得的结果及结论: 1、通过大鼠坐骨神经预变性、混合酶消化法及G-418筛选,可以培养获取高纯度的雪旺细胞。 2、选择安全性较高的高拷贝真核表达载体pcDNA3.1,可以将外源性bfgf基因片段与pcDNA3.1进行重组,获取含目的基因片段的真核表达体系。 3、将重组bfgf- pcDNA3.1质粒通过脂质体转染法导入雪旺细胞后外源性bfgf基因能即时、持续、稳定表达,极大提高bfgf的表达水平。结论:(1)将bfgf基因以pcDNA3.1为载体通过脂质体转染导入雪旺细胞,能使雪旺细胞在体外培养过程中表达分泌bfgf;(2)经过bfgf基因修饰的雪旺细胞能持续稳定高水平的表达分泌bfgf;但在体外培养过程中因细胞生长条件限制而可能出现细胞bfgf分泌水平降低现象;(3)将bfgf基因与雪旺细胞移植载体相结合,具有独特的优势,不但能为损伤脊髓及时提供稳定高水平的bfgf,还可为神经轴突再生提供支持和引导,这将为损伤脊髓神经元的修复、再生提供极为有利的条件,为临床脊髓损伤的治疗开辟新的前景。

关键词： bfgf基因雪旺细胞转染

bfgf基因修饰的骨髓基质细胞复合多孔矿化Bio-Oss胶原修复下颌骨缺损的实验研究

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实用口腔医学杂志 2008年第4期24卷 470-474页

作者：李春明杨春艳王鑫刘宝林焦晓辉黑龙江哈尔滨医科大学附属第二医院口腔颌面外科 150086 西安第四军医大学口腔医院口腔颌面外科哈尔滨医科大学附属口腔医学院

目的:观察经bfgf基因转染的兔骨髓基质细胞复合多孔矿化Bio-Oss骨胶原修复下颌骨缺损的效果。方法:标准成年新西兰白兔12只随机分3组,单纯Bio-Oss骨胶原组,BMSCs+凝胶+Bio-Oss骨胶原组,bfgf基因转染BMSCs+胶原+Bio-Oss骨胶原组于术后8... 详细信息

目的:观察经bfgf基因转染的兔骨髓基质细胞复合多孔矿化Bio-Oss骨胶原修复下颌骨缺损的效果。方法:标准成年新西兰白兔12只随机分3组,单纯Bio-Oss骨胶原组,BMSCs+凝胶+Bio-Oss骨胶原组,bfgf基因转染BMSCs+胶原+Bio-Oss骨胶原组于术后8周取材,行肉眼、组织学观察骨缺损的修复情况。结果:单纯Bio-Oss骨胶原材料组:缺损区大量的未吸收的支架材料周围可见有类骨样组织;BMSCs+凝胶+Bio-Oss骨胶原材料组:缺损区大量的未吸收的支架材料周围可见有大量间充质细胞聚集、分化,有较幼稚的编织骨形成;bfgf基因转染BMSCs+凝胶+Bio-Oss骨胶原材料组:支架材料周围,大量新骨形成,新骨表面可见活跃的成骨细胞,部分区域有成熟骨组织形成,并有新生的毛细血管形成。结论:Bio-Oss骨胶原有较强的诱导成骨能力;Bio-Oss骨胶原为载体的自体骨髓基质细胞移植能有效修复骨缺损,是骨组织工程良好的支架材料;兔骨髓基质细胞体外表达人bfgf基因,并且经基因修饰的组织工程骨修复骨缺损效果最佳。

关键词： bfgf基因骨髓基质细胞 Bio—Oss骨胶原移植下颌骨

种植体＋bfgf基因修饰骨髓基质细胞复合Bio-Oss胶原修复犬颌骨缺损的实验研究

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实用口腔医学杂志 2009年第1期25卷 26-30页

作者：李春明王鑫刘宝林杨春艳黑龙江哈尔滨医科大学附属第二医院口腔颌面外科 150086 西安第四军医大学口腔医院口腔颌面外科

目的:(1)观察经bfgf基因转染的犬骨髓基质细胞(BMSC)复合多孔矿化Bio-Oss胶原骨修复下颌骨极限骨缺损的效果。(2)观察骨融合种植体与骨髓来源的成骨细胞及多孔矿化Bio-Oss胶原支架复合体,植入体内后新骨的形成及与种植体的愈合情况。方... 详细信息

目的:(1)观察经bfgf基因转染的犬骨髓基质细胞(BMSC)复合多孔矿化Bio-Oss胶原骨修复下颌骨极限骨缺损的效果。(2)观察骨融合种植体与骨髓来源的成骨细胞及多孔矿化Bio-Oss胶原支架复合体,植入体内后新骨的形成及与种植体的愈合情况。方法:用脂质体转染技术将bfgf基因转入犬BMSC,将转染和未转染细胞分别与Bio-Oss及凝胶复合。杂种犬8只,按植入物不同分为2组:(1)种植体+犬BMSC+凝胶+Bio-Oss胶原材料组;(2)种植体+bfgf基因转染犬BMSC+凝胶+Bio-Oss胶原材料组,修复犬下颌骨极限骨缺损。于术后24周取材,分别行大体、放射线、组织学观察骨缺损的修复情况。结果:(1)种植体+犬BMSC+凝胶+Bio-Oss骨胶原组,基本上由新生骨组织所修复,但骨组织密度稍不均匀,种植体与周围骨组织基本上形成骨结合。(2)种植体+bfgf基因转染犬BMSC+凝胶+Bio-Oss胶原材料组:骨缺损区基本由新生成熟的骨组织所修复,骨小梁形成,与种植体骨结合良好。结论:Bio-Oss骨胶原为载体的自体骨髓基质细胞移植能有效地修复骨缺损,是骨组织工程良好的支架材料,并且种植体与组织工程骨能够形成良好的骨结合。

关键词： Bio-Oss骨胶原移植下颌骨骨修复 bfgf基因

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bfgf基因修饰雪旺细胞表达的实验研究

中国骨与关节损伤杂志 2009年第12期24卷 1089-1092页

作者：王锋苑占永刘文革武警福州市支队医院骨科福建省福州市350001 福建医科大学附属协和医院骨科

目的利用基因工程技术将外源bfgf基因以质粒pcDNA3.1为载体导入大鼠雪旺细胞,观察外源bfgf基因在雪旺细胞中的表达水平。方法通过预变性大鼠坐骨神经、混合酶消化法获取高纯度的雪旺细胞;将真核表达质粒pcDNA3.1及外源bfgf基因片段双酶... 详细信息

目的利用基因工程技术将外源bfgf基因以质粒pcDNA3.1为载体导入大鼠雪旺细胞,观察外源bfgf基因在雪旺细胞中的表达水平。方法通过预变性大鼠坐骨神经、混合酶消化法获取高纯度的雪旺细胞;将真核表达质粒pcDNA3.1及外源bfgf基因片段双酶切,酶切片段回收后重组bfgf-pcDNA3.1质粒;通过脂质体转染法将pcDNA3.1-bfgf质粒导入雪旺细胞,用ELISA及RT-PCR方法分别从蛋白质水平及mRNA水平检测bfgf的表达情况。结果经外源bfgf基因修饰的大鼠雪旺细胞,bfgf的表达水平极大提高(H=126.835,v=2,P=0.000),并且相对持续、稳定。结论bfgf基因修饰的雪旺细胞能持续稳定高水平地表达分泌bfgf,将bfgf基因与雪旺细胞移植载体相结合治疗脊髓损伤具有独特的优势,为下一步bfgf基因修饰细胞治疗大鼠脊髓损伤的实验研究奠定了基础。

关键词： bfgf基因雪旺细胞转染

bfgf基因与体外转染缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞的相关性

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中国医药指南 2019年第28期17卷 95-96页

作者：刘效波荆丽杰刘宝堂侯文明李磊赵进李子军潍坊医学院附属医院心血管外科

目的探究bfgf基因与体外转染缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞的相关性。方法采用Lipofectamine转染试剂将重组真核表达质粒pIRFS2-EGFP-bfgf来转染缺血性心肌病患者的骨髓基质干细胞。观察患者转基因效率和bfgf浓度变化情况。结果最初... 详细信息

目的探究bfgf基因与体外转染缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞的相关性。方法采用Lipofectamine转染试剂将重组真核表达质粒pIRFS2-EGFP-bfgf来转染缺血性心肌病患者的骨髓基质干细胞。观察患者转基因效率和bfgf浓度变化情况。结果最初的标记基因荧光强度最强,从4~48 hEGFP阳性细胞数量逐渐增多,转基因效率逐渐升高,而在48~72 h内强度逐渐减弱,转基因效率反而有所下降,差异具有统计学意义(Pbfgf浓度逐渐升高到23.5ng/ml,而在48~72 h内浓度慢慢降低。差异具有统计学意义(Pbfgf基因体外转染对于缺血性心肌病患者的骨髓基质干细胞的增殖和分化具有较好的促进作用。

关键词： bfgf基因缺血性心肌病骨髓基质干细胞

bfgf基因启动子区-921C＞G单核苷酸多态性与脊柱融合的相关性研究

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中国骨肿瘤骨病 2011年第4期10卷 378-381页

作者：刘伟波陈晓亮王德春西永明周传利山东省青岛大学医学院附属医院骨科 266003

目的研究山东半岛地区人群中,bfgf基因启动子区-921C>G单核苷酸多态性与脊柱融合的相关性。方法采用PCR及基因测序方法,检测225例脊柱融合患者外周血中bfgf基因C>G单核苷酸多态性情况,并根据术后不同时间随访X线的表现,分析其与脊柱术... 详细信息

目的研究山东半岛地区人群中,bfgf基因启动子区-921C>G单核苷酸多态性与脊柱融合的相关性。方法采用PCR及基因测序方法,检测225例脊柱融合患者外周血中bfgf基因C>G单核苷酸多态性情况,并根据术后不同时间随访X线的表现,分析其与脊柱术后植骨融合疗效之间的关系。结果病例组中均符合Hardy-Weinberg平衡检验(P>0.05),在病例组中,融合组和非融合组CC基因型与CG+GG基因型分布有统计学意义(P=0.026),融合速度CC基因型与CG+GG基因型分布在颈椎有统计学意义(P=0.025)。结论在山东半岛地区人群中,bfgf基因C>G单核苷酸多态性与植骨融合间存在显著性差异且与颈椎植骨融合速度之间存在相关性。

关键词： bfgf基因脊柱融合基因多态性

bfgf基因体外转染兔骨髓间充质干细胞及对其增殖的影响

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浙江中西医结合杂志 2011年第8期21卷 534-536页

作者：许杨李江何建明何小勇陶铁瑛胡松峰浙江省绍兴市中医院骨伤科绍兴312000

目的:观察bfgf基因体外转染兔骨髓间充质干细胞(bMSCs)后细胞目的基因的表达及对其增殖的影响。方法:将兔骨髓来源的间充质干细胞分离培养扩增,用PCR扩增法获得绿色荧光蛋白-bfgf基因重组质粒,转染间充质干细胞,用荧光显微镜观察转染后... 详细信息

目的:观察bfgf基因体外转染兔骨髓间充质干细胞(bMSCs)后细胞目的基因的表达及对其增殖的影响。方法:将兔骨髓来源的间充质干细胞分离培养扩增,用PCR扩增法获得绿色荧光蛋白-bfgf基因重组质粒,转染间充质干细胞,用荧光显微镜观察转染后绿色荧光蛋白基因的表达,计算转染率,用MTT检测转染细胞的增殖特性。结果:实验成功地构建了绿色荧光蛋白-bfgf基因重组质粒,倒置荧光显微镜下观察到转染后的bMSCs发出稳定的绿色荧光信号,转染率为(43.32±4.51)%,MTT法显示重组质粒组增殖速度显著高于空白质粒组和未转染细胞组(P基因在MSCs中的共同表达,为监控MSCs细胞的转染和表达过程提供了一种手段。为后期利用MSCs细胞进行组织工程骨组织制造和移植提供了规范化的监控和程序化生产手段。

关键词：兔 bfgf基因骨髓间充质干细胞体外转染

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bfgf基因转染MSC的鉴定

中国继续医学教育 2015年第16期7卷 47-48页

作者：王彦生于宁沈阳医学院附属中心医院手外科 110024

目的探讨b FGF(外源性碱性成纤维细胞生长因子)基因转染骨髓间充质细胞(MSC)的鉴定方法。方法提取大鼠骨髓间充质细胞,体外培养后,随机分为b FGF组(构建b FGF基因病毒质粒,移植到MSC),正常组和阴性组(转染***),通过免疫組化染色法观察MS... 详细信息

目的探讨b FGF(外源性碱性成纤维细胞生长因子)基因转染骨髓间充质细胞(MSC)的鉴定方法。方法提取大鼠骨髓间充质细胞,体外培养后,随机分为b FGF组(构建b FGF基因病毒质粒,移植到MSC),正常组和阴性组(转染***),通过免疫組化染色法观察MSC的形态,同时应用Western-Blot法分析b FGF基因表达情况。结果阴性组和正常组均无转染b FGF,b FGF组胞浆呈黄色,Western-Blot分析可见b FGF特异性条带,其表达量为0.85,高于正常组及阴性组,P>0.05,差异不具有统计学意义。结论将病毒作为载体能够成功实现b FGF基因转染MSC,得到目的基因阳性表达。

关键词： bfgf基因骨髓间充质细胞细胞转染