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转录因子HoxA11靶向提高PD-L1促进奶牛子宫内膜上皮细胞质膜转化的机制研究

转录因子HoxA11靶向提高PD-L1促进奶牛子宫内膜上皮细胞质膜转化...

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作者：尹宝仪华中农业大学

学位级别：硕士

尽管近年来我国奶牛产业发展良好,饲养规模逐渐增大,但奶牛的繁殖障碍问题仍严重制约着奶牛产业的发展。在实际生产中,早期胚胎流失导致的奶牛不孕是造成养殖业经济损失的主要原因之一。研究表明,子宫内膜容受性低下往往是造成胚胎着床... 详细信息

尽管近年来我国奶牛产业发展良好,饲养规模逐渐增大,但奶牛的繁殖障碍问题仍严重制约着奶牛产业的发展。在实际生产中,早期胚胎流失导致的奶牛不孕是造成养殖业经济损失的主要原因之一。研究表明,子宫内膜容受性低下往往是造成胚胎着床失败和流失的最主要因素。有学者指出,妊娠初期子宫内膜可在一系列激素共同作用下发生质膜转化,进而为胚胎附植提供良好的生理环境和结构基础。这是子宫成功建立容受态的标志,该过程的失调将直接导致胚胎容受的失败和流失。同源框基因HoxA11已被证实在哺乳动物胚胎附植中发挥重要作用,且雌激素和孕激素可使HoxA11表达量剧增,其基因产物作为转录因子可靶向其他基因调控子宫内膜的发育。PD-L1作为PD-1的配体,在介导机体免疫耐受过程中发挥重要作用。但PD-L1作为一个单独的基因来看,其功能自主性仍值得更深一步的探索。在癌症相关研究中,曾报道PD-L1可通过PI3K/AKT信号通路促进癌细胞发生上皮-间质(EMT)转化并具有促进细胞迁移的作用,而这一过程与子宫内膜上皮细胞在容受性子宫内膜形成阶段所发生的质膜转化是高度相似的。因此PD-L1能否在妊娠初期子宫内膜上皮细胞质膜转化过程中发挥作用值得关注和探索。本研究旨在阐明HoxA11和PD-L1在奶牛妊娠初期子宫内膜上皮细胞质膜转化中的作用机制,对改善奶牛子宫内膜容受态进而提高奶牛繁殖力具有重要的科学参考意义和临床价值。相关研究内容及结果如下:1.妊娠初期奶牛子宫内膜发生质膜转化确认采集的奶牛组织样本所处的妊娠时期后,利用组织IF和IHC技术检测了妊娠初期子宫内膜质膜转化标志物E-cadherin/N-cadherin的表达水平,发现处于妊娠初期的子宫内膜上皮细胞E-cadherin的检出信号较弱,而N-cadherin的阳性率更高,提示妊娠初期子宫内膜出现了质膜结构变化。此外,q RT-PCR结果表明,妊娠初期子宫内膜容受态标志HoxA10、ITGB3基因的表达显著升高,这也提示了胚胎围殖入期子宫内膜发生质膜转化与容受态建立的密切相关性。2.激素作用可使HoxA11及PD-L1的表达上调,并促进beecs发生质膜转化通过组织样品检测,发现妊娠初期HoxA11和PD-L1基因的表达相比未孕时期均显著增多,提示二者可能在妊娠初期发挥一定的作用。体外实验发现当E2、P4和IFN-τ三者联合作用beecs时,可以显著促进HoxA11和PD-L1基因的表达,并促进质膜转化标志物N-cadherin和Vimentin表达量的提高。与此同时,极性蛋白基因(par3、LLGL2)和紧密连接分子(ZO-1、occludin)的m RNA水平也可在激素联合作用下显著降低,提示细胞极性和紧密连接性的下降,与上皮细胞发生质膜转化的标志事件相符。***11与PD-L1可以促进beecs发生质膜转化分别设计并构建HoxA11及PD-L1慢病毒干扰载体p CD513B-U6-sh HoxA11及p CD513B-U6-sh PD-L1,包毒感染beecs建立HoxA11及PD-L1敲低细胞系。发现在E2、P4和IFN-τ作用下,干扰HoxA11或PD-L1的表达均可抑制beecs质膜转化,具体表现为:极性蛋白基因和紧密连接分子的高表达,间质细胞标志蛋白N-cadherin和Vimentin的下降,上皮细胞标志蛋白CK18的上升,细胞表面微绒毛的增多和细胞迁移速度的降低。证明HoxA11和PD-L1可能作为激素调节基因参与激素对子宫内膜上皮发生质膜转化的调控过程。***11可作为转录因子靶向促进PD-L1的表达JASPAR数据库提示转录因子HoxA11或可通过靶向PD-L1的启动子序列促进PD-L1基因的转录和表达,并列出PD-L1启动子区域中所有可能与转录因子HoxA11结合互作的位点(Binding Site)。选取预测分值排名前三的序列,利用双荧光素酶报告基因实验进行验证。最终证明HoxA11可以促进PD-L1基因的表达,且Binding Site2(TCTTGTAAAAGA)是PD-L1启动子上与转录因子HoxA11结合的最佳靶点。***-L1通过PI3K/AKT信号通路调控子宫内膜重塑String数据库显示PD-L1与PI3K/AKT信号通路中的核心蛋白存在互作关系。利用Western blot和IF实验对PI3K和AKT蛋白进行检测,发现激素联合作用下,PI3K/AKT信号通路可被激活。但当PD-L1被敲低后,PI3K和AKT蛋白则无法在激素作用下发生磷酸化,这提示着PD-L1或可通过PI3K/AKT信号通路促进妊娠初期子宫内膜发生质膜转化。综合上述实验结果,证明雌激素、孕酮和IFN-τ可以提高转录因子HoxA11表达,且HoxA11通过靶向提高PD-L1表达,促进beecs在妊娠

关键词：奶牛 beecs HoxA11 PD-L1 子宫内膜质膜转化

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bAD-MSCs对奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤修复的研究

bAD-MSCs对奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤修复的研究

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作者：司琳清黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

氧化应激与多种奶牛繁殖障碍疾病密切相关,在奶牛子宫内膜炎中,活性氧(Reactive oxygen species,ROS)既可以作为炎性分子,也可以作为炎性介质参与其病理进程,因此抗氧化应激在奶牛子宫内膜炎的防治中起着重要作用,而目前的研究尚未发现... 详细信息

氧化应激与多种奶牛繁殖障碍疾病密切相关,在奶牛子宫内膜炎中,活性氧(Reactive oxygen species,ROS)既可以作为炎性分子,也可以作为炎性介质参与其病理进程,因此抗氧化应激在奶牛子宫内膜炎的防治中起着重要作用,而目前的研究尚未发现有效的“替抗”疗法。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)由于其强大的生物学功能在许多疾病模型及动物临床中都有广泛的研究及应用。由于奶牛子宫内膜上皮细胞(Bovine endometrial epithelial cells,beecs)是奶牛子宫先天免疫的重要部分,因此本试验通过使用HO构建beecs氧化应激模型,并探讨奶牛脂肪间充质干细胞(Bovine adipose-derived mesenchymal stem cells,b AD-MSCs)在beecs氧化应激模型中的作用,旨在为临床上奶牛子宫内膜炎的防治提供新的思路。试验1:使用浓度为0、5、25、50、100和200μmol/L的HO分别处理beecs 2、4、6、8及12 h后,通过MTT试验检测细胞存活率、流式细胞术检测细胞内ROS水平来筛选HO诱导beecs氧化应激模型的最佳条件,随后通过在细胞划痕试验后使用孔径为0.4μm的transwell构建共培养体系,分析细胞迁移能力及Erk蛋白的表达水平。试验结果显示,HO浓度为50μmol/L时细胞存活率在50%～80%之间,当使用50μmol/L的HO刺激2 h时,ROS水平显著升高,HO的处理使beecs的迁移能力及细胞内p Erk的蛋白表达水平显著下降(Pbeecs的迁移能力与p Erk的蛋白表达水平都显著增强(Pbeecs氧化应激模型后,使用孔径为0.4μm的transwell构建共培养体系,通过流式细胞术检测ROS水平;利用q PCR检测Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和GSH-Px的m RNA表达水平;采用Western blotting检测细胞内Nrf2、HO-1以及NQO1的蛋白表达水平。结果显示,b AD-MSCs的共培养可以使beecs氧化应激模型中ROS水平显著下调,而使Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和GSH-Px的m RNA表达水平上调,同时,Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达水平也显著增加(Pbeecs氧化应激模型后,使用孔径为0.4μm的transwell构建共培养体系,通过流式细胞术检测细胞凋亡情况;利用Western blotting检测Bax、Bcl2和Bcl-xl的蛋白表达水平以及NF-κB p65与p38等凋亡相关通路蛋白的表达水平。结果显示,b AD-MSCs的共培养可以显著抑制HO引起的细胞凋亡(Pbeecs氧化应激模型的最佳条件,表明了b AD-MSCs通过上调p Erk的蛋白表达促进氧化应激状态下beecs的迁移;阐明了b AD-MSCs通过上调Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和GSH-Px的m RNA表达及Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达进而抑制beecs氧化应激模型中ROS的产生,b AD-MSCs通过下调NF-κB p65、p-NF-κB p65和p-p38的表达来促进Bcl2和Bcl-xl的蛋白表达并抑制Bax的蛋白表达,进而抑制细胞凋亡。为奶牛子宫内膜炎的“替抗”疗法奠定了理论基础。

关键词： beecs 氧化应激 bAD-MSCs 迁移抗凋亡

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