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国产avidin-hrp免疫组化检测试剂的鉴定与应用

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天津医药 1990年第3期18卷 176-177页

作者：陈辉树孙保存王欣中国医学科学院血液学研究所天津医学院病理教研室

1981年 Hsu SM 首先报告了 ABC 免疫组化检测方法快速、灵敏及反应产物稳定,已广泛用于基础与临床研究。但国内目前尚无可靠的 ABC 试剂。为寻求敏感度高而价低的国产免疫组化试剂。

关键词： avidin-hrp 检测试剂鉴定

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离子液体和聚苯胺纳米管修饰丝网印刷DNA生物传感器的应用研究

离子液体和聚苯胺纳米管修饰丝网印刷DNA生物传感器的应用研究

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作者：冷翠翠青岛科技大学

学位级别：硕士

本研究构建了掺杂导电油墨制作的丝网印刷电极,并将其用于对特定DNA片段和肿瘤细胞进行识别和测定,为许多疾病的临床早期诊断提供基础性研究。本文着重进行了三种类型的DNA传感器的研制和性质研究:1.丝网印刷电极的构建。合成了形貌、... 详细信息

本研究构建了掺杂导电油墨制作的丝网印刷电极,并将其用于对特定DNA片段和肿瘤细胞进行识别和测定,为许多疾病的临床早期诊断提供基础性研究。本文着重进行了三种类型的DNA传感器的研制和性质研究:1.丝网印刷电极的构建。合成了形貌、尺寸和电导率适当的聚苯胺纳米管,然后将室温离子液体与所合成的聚苯胺纳米管共同掺杂入导电油墨中,用于制造三电极丝网印刷DNA传感器中的工作电极,再用壳聚糖膜加以覆盖修饰电极。优化了掺杂和修饰条件,在最佳条件下所得的电极具有较低的表面阻抗和较高的电化学灵敏度。2.基于这个传感器建立了一种基于酶放大的DNA夹心检测的方法。将avidin修饰的辣根过氧化物酶(avidin-hrp)固定到杂交好的DNA上,通过hrp催化底物邻氨基酚和双氧水反应产生信号。在实验选定的最佳条件下,得到了目标DNA的线性范围为8×10-14-2×10-13 M,检测限为8.37×10-15 M。另外,三碱基错配序列和完全非互补序列的杂交情况同样被检测。其中,三碱基错配序列显示有微弱的电化学信号而完全非互补序列则无信号检出。这说明我们设计的DNA传感器具有良好的选择性。3.在以上工作的基础上,我们改进了实验方法,研究了另一种灵敏度更高的基于六氨基钌和金纳米粒子放大信号的电化学方法法检测DNA特定序列的生物传感器。首先,将巯基修饰的捕获DNA固定在纳米金修饰的丝网印刷电极表面,之后分别与目标DNA和标记金纳米粒子的3'位巯基修饰的检测探针、探针杂交,形成了“夹心”式的DNA杂交复合物。通过六氨基钌特异性吸附到纳米金结合的单链DNA中,六氨基钌发生氧化还原反应产生信号通过计时电量法检测信号进一步增强了检测的灵敏度。结合以上两种因素,该DNA传感器可检测到10-17的低浓度的目标DNA,并在三碱基错配DNA的测定上显示出良好的选择性。同时,对实验的最佳检测条件进行了选择。在最佳条件下进行检测,得到了目标DNA的8×10-17 M的检测限,检测的线性范围为1.0×10-16 M到1.0×10-14 M。4.我们又深入研究制作了一种可以检测肿瘤细胞的传感器。这种传感器是以Ramos肿瘤细胞的适体识别以及DNA序列的循环复制替换为基础构建的。这一检测方案分两步进行:首先,将适体序列DNA固定在磁珠上后与“信使序列”杂交,Ramos细胞与这一杂交复合体结合导致信使序列DNA释放出来;将发卡序列固定在电极上,释放出的信使序列与其“环”部分杂交,颈环部分被打开,再与金纳米颗粒结合的引物DNA杂交形成杂交复合体,并在DNA复制酶、脱氧三磷酸核苷酸混合物(dNTP)和镁离子存在下引发以引物为起点的DNA聚合反应,反应过程中形成一条与发卡探针互补的新链,同时信使序列DNA被替换而释放到溶液中,找到另一个发卡探针开始新的循环复制。引物序列上的纳米金颗粒同时附有分子条码序列,其上吸附有六氨基钌,通过计时电量法检测六氨基钌的氧化还原信号,进一步增强了检测的灵敏度。结合以上两种因素,该DNA传感器可检测到10-17的低浓度的目标DNA,也可以检测1 ml溶液中含有100个细胞,并在三碱基错配DNA的测定上显示出良好的选择性。同时,对含有其他干扰细胞时该传感器也可以显示出良好的选择性。该研究还对实验的最佳检测条件进行了选择。

关键词：丝网印刷电极聚苯胺纳米管离子液体 avidin-hrp 六氨基钌金纳米颗粒肿瘤细胞

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