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枯草芽孢杆菌核黄素合成途径相关基因的修饰

枯草芽孢杆菌核黄素合成途径相关基因的修饰

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作者：夏苗苗天津大学

学位级别：硕士

在枯草芽孢杆菌的核黄素合成代谢途径中，核黄素操纵子（rib）表达水平与核黄素激酶/FAD合成酶（ribC）活性，是影响核黄素过量合成的关键因素。本文研究了rib操纵子表达元件的修饰和mRNA稳定子替换的效应，以及ribC基因点突变对核黄素... 详细信息

在枯草芽孢杆菌的核黄素合成代谢途径中，核黄素操纵子（rib）表达水平与核黄素激酶/FAD合成酶（ribC）活性，是影响核黄素过量合成的关键因素。本文研究了rib操纵子表达元件的修饰和mRNA稳定子替换的效应，以及ribC基因点突变对核黄素过量合成的影响。首先采用DNA片段和质粒原生质体转化方法，对***24A1菌株的基因重组能力进行了检验，发现其在原生质体状态下没有同源重组能力，或者重组率低于4×10-3，不适合作为基因修饰的出发菌株。以***30为出发菌，通过氯霉素抗性基因与rib操纵子启动子区的双交换重组，构建了核黄素缺陷株***31，作为rib操纵子表达元件进一步修饰的出发菌。通过同源重组方式，分别构建了rib操纵子启动子-35区consensus化修饰，mRNA前导区被gsiBmRNA稳定子替换的重组菌株***32;以及rib操纵子启动子-35区consensus化修饰，mRNA前导区被asnHmNRA稳定子替换的重组菌***33。采用qRT-PCR方法检测重组菌胞内rib操纵子转录的mRNA水平，发现使用gsiBmRNA稳定子修饰的rib操纵子，其mRNA水平相对出发菌提高1531倍;使用asnHmNRA稳定子修饰的rib操纵子，其mRNA水平相对出发菌提高9倍。结果表明，rib操纵子启动子-35区consensus化修饰，以及采用gsiBmRNA稳定子替换mRNA前导区，能够使rib操纵子组成型高表达。用带有***24A1突变型ribC基因及红霉素抗性标记的重组质粒，转化菌株LX32，在抗性平板上筛选得到了黄色菌落LX34。经测序验证，发现LX34菌株ribC基因的启动子-35区第一个碱基发生了T→C点突变。摇管发酵显示，LX34菌株培养36h，核黄素产量达到2.13g/L，高于24A1菌株1.94g/L的产量，且菌株LX34的生长能力优于24A1。结果表明，ribC基因启动子-35区的T→C点突变，其遗传效应与编码序列的G596A突变相当，可以使核黄素过量合成。

关键词： rib操纵子 ribC基因 gsiBmRNA稳定子 asnhmrna稳定子核黄素枯草芽孢杆菌

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