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Blockade of arf1-mediated lipid metabolism in cancers promotes tumor infiltration of cytotoxic T cells via the LPE-PPARγ-NF-κB-CCL5 pathway

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Life Metabolism 2023年第5期2卷 25-37页

作者： Na Wang Tiange Yao Chenfei Luo Ling Sun Yuetong Wang Steven X.Hou Department of Cell and Developmental Biology at School of Life Sciences State Key Laboratory of Genetic EngineeringInstitute of Metabolism and Integrative BiologyHuman Phenome InstituteFudan UniversityShanghai 200438China

Tumor immunotherapy has achieved breakthroughs in a variety of tumors. However, the systemic absence of T cells in tumors and immunosuppressive tumor microenvironment so far limits the efficacy of immunotherapy to a small population of patients. Therefore, novel agents to increase T-cell tumor infiltration are urgently needed in the clinic. We recently found that inhibition of the ADP-ribosylation factor 1 (arf1)-mediated lipid metabolism not only kills cancer stem cells (CSCs) but also elicits an anti-tumor immune response. In this study, we revealed a mechanism that targeting arf1 promotes the infiltration of cytotoxic T lymphocytes (CTLs) into tumors through the C-C chemokine ligand 5 (CCL5)- C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) pathway. We found that blockage of arf1 induces the production of the unsaturated fatty acid (PE 18:1) that binds and sequestrates peroxisome proliferator- activated receptor-γ (PPARγ) from the PPARγ-nuclear factor-κB (NF-κB) cytoplasmic complex. The released NF-κB was then phospho-rylated and translocated into the nucleus to regulate the transcription of chemokine CCL5. CCL5 promoted infiltration of CTLs for tumor regression. Furthermore, the combination of the arf1 inhibitor and programmed cell death protein 1 (PD-1) blockade induced an even stronger anti-tumor immunity. Therefore, targeting arf1 represents a novel anti-tumor immune approach by provoking T-cell tumor infiltration and may provide a new strategy for tumor immunotherapy.

关键词： immune checkpoint blockade cancer stem cells cytotoxic T cells PPARγ CCL5-CCR5 pathway arf1

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arf1-mTORC1信号网络感应谷氨酰胺促进猪肠上皮细胞增殖的机制研究

Arf1-mTORC1信号网络感应谷氨酰胺促进猪肠上皮细胞增殖的机制研究

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作者：闫玲贵州大学

学位级别：硕士

谷氨酰胺(Glutamine)是肠道上皮细胞的首选能量底物,在肠道发育和稳态中发挥重要作用。然而,肠上皮细胞响应谷氨酰胺的机制有待研究揭示。本研究采用IPEC-J2细胞为材料,通过CCK8、免疫荧光染色、基于串联质量标签(Tandem Mess Tags,TMT... 详细信息

谷氨酰胺(Glutamine)是肠道上皮细胞的首选能量底物,在肠道发育和稳态中发挥重要作用。然而,肠上皮细胞响应谷氨酰胺的机制有待研究揭示。本研究采用IPEC-J2细胞为材料,通过CCK8、免疫荧光染色、基于串联质量标签(Tandem Mess Tags,TMT)磷酸化蛋白质组学、蛋白质免疫印迹(Western Blotting,WB)、实时荧光定量PCR、敲低质粒构建等技术探究了谷氨酰胺通过二磷酸腺苷-核糖化因子1(ADP-ribosylation factor 1,arf1)激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(Mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)促进猪肠上皮细胞增殖的分子机制。主要研究结果如下:1.采用CCK8法和免疫荧光染色检测谷氨酰胺对猪肠上皮细胞增殖的影响。研究发现,在氨基酸饥饿处理条件下,与对照组(0 mmol/L谷氨酰胺)相比,添加0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、4 mmol/L和5 mmol/L谷氨酰胺处理IPEC-J2细胞6 h均能显著提高细胞活力,其中1 mmol/L、2 mmol/L和4mmol/L谷氨酰胺处理组显著高于0.5 mmol/L和5 mmol/L处理组,但1mmol/L、2 mmol/L和4 mmol/L谷氨酰胺处理组之间无显著差异。不同浓度谷氨酰胺处理IPEC-J2细胞24 h与处理6 h结果基本一致。因此采用1 mmol/L谷氨酰胺开展后续研究。2.磷酸化蛋白质组分析显示,谷氨酰胺显著上调了S6在丝氨酸235/236位点的磷酸化,提示谷氨酰胺激活mTORC1信号通路。Western Blotting结果证实p-S6(Ser235/236)蛋白质表达水平显著上调,p-S6的免疫荧光染色结果与Western Blotting结果一致。此外,mTORC1信号通路关键靶标p-mTOR和pS6K1的表达水平均显著上调。mTORC1抑制剂雷帕霉素(Rapamycin,Rap)试验进一步验证mTORC1参与谷氨酰胺促进IPEC-J2细胞增殖的过程。3.实时荧光定量PCR结果表明,谷氨酰胺显著提高arf1和Rag A的mRNA丰度,但对Rag B的mRNA丰度无显著影响。Western Blotting检测结果与实时荧光定量PCR结果一致。布雷非德菌素A(Brefeldin A,BFA)是arf1功能的特异性抑制剂,BFA抑制剂试验显示其降低了谷氨酰胺诱导的p-S6K1和p-S6的蛋白质表达水平,且arf1干扰试验显示其也降低了谷氨酰胺诱导的p-mTOR和p-S6K1的蛋白质表达水平,进一步证实了arf1参与谷氨酰胺诱导的mTORC1激活促进IPEC-J2细胞增殖的过程。此外,敲除Rag A并没有改变谷氨酰胺对mTORC1的激活。因此,谷氨酰胺激活mTORC1通路依赖于arf1,而不依赖于Rag A/B GTPases。综上所述,在IPEC-J2细胞中,谷氨酰胺通过arf1-mTORC1信号通路促进细胞增殖,而不依赖于Rag GTPase。本论文阐明了mTORC1感应谷氨酰胺促进猪肠上皮细胞增殖的分子路径,丰富了氨基酸营养调控理论,为谷氨酰胺更好地应用于生产提供理论依据。

关键词：谷氨酰胺 arf1 mTORC1 猪肠上皮细胞细胞增殖

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arf1在牛卵母细胞第一次减数分裂中的作用研究

ARF1在牛卵母细胞第一次减数分裂中的作用研究

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作者：史芸安西北农林科技大学

学位级别：硕士

在哺乳动物卵母细胞减数分裂过程中，卵母细胞经过连续的两次减数分裂产生一个大的卵和两个小的极体，这种细胞质的不均等分配对于保留母本资源来支持后期胚胎发育是非常必要的。其中一些小GTP酶，比如RAC，RAN和CDC42等，它们在皮质极... 详细信息

在哺乳动物卵母细胞减数分裂过程中，卵母细胞经过连续的两次减数分裂产生一个大的卵和两个小的极体，这种细胞质的不均等分配对于保留母本资源来支持后期胚胎发育是非常必要的。其中一些小GTP酶，比如RAC，RAN和CDC42等，它们在皮质极化和纺锤体附着方面起着重要作用，如果抑制它们的活性，卵母细胞的胞质分裂就会出现异常。这里我们研究了一个小GTP酶arf1在牛卵母细胞第一次减数分裂过程中的作用，发现它的功能缺失能够引起卵母细胞第一次减数分裂纺锤体异常，并导致分裂失败。在小鼠上，抑制arf1活性后，导致了小鼠卵母细胞第一次减数分裂细胞的均等分裂，产生了两个相等大小的第二次减数分裂期的卵。本试验用牛卵母细胞作为试验材料，对arf1在牛卵母细胞第一次减数分裂过程中的作用进行了研究。首先，我们用RT-PCR技术，确定了arf1基因在牛卵母细胞成熟过程中都有表达;其次，从牛卵丘细胞中克隆得到arf1基因，并利用重叠延伸PCR方法构建了arf1的两个突变体，一个是失活突变体arf1，另一个是活化突变体arf1，最终构建了pVenus-arf1和pVenus-arf1真核表达载体，并分别将其体外转录为RNA。最后，我们将Venus-arf1的RNA显微注射到GV期牛卵母细胞，以确定活性arf1在牛卵母细胞成熟过程中的定位;另外，分别将Venus-arf1的RNA和arf1Morpholino(MO)显微注射到GV期牛卵母细胞来抑制arf1活性，以确定抑制arf1的活性对牛卵母细胞第一次减数分裂的影响;最终，用布雷菲德菌素(BFA)来处理GV期牛卵母细胞来抑制arf1的活性，以确定BFA对牛卵母细胞第一次减数分裂的影响。试验研究得到以下结果： 1、利用RT-PCR技术，在mRNA水平上检测了牛卵母细胞成熟过程中arf1的表达情况，结果显示arf1在牛卵母细胞成熟过程中都有较高的表达水平。 2、利用RT-PCR技术，成功从牛卵丘细胞中克隆得到arf1基因的CDS序列全长，并连接到pMD18-T上，与NCBI上公布的arf1序列对比后，同源性为100%。然后利用重叠延伸PCR，成功构建了arf1两个突变体，arf1和arf1，并连接到pVenus真核表达载体上，成功构建了pVenus-arf1和pVenus-arf1真核表达载体，将其转染到Hela细胞能够正确表达。 3、体外转录成功获得Venus-arf1和Venus-arf1的RNA。将Venus-arf1的mRNA注射到GV期牛卵母细胞，观察arf1在牛卵母细胞成熟各个时期的定位。Venus-arf1的mRNA或者arf1MO注射到GV期牛卵母细胞抑制arf1活性，观察对牛卵母细胞第一次减数分裂的影响。 4、用BFA处理GV期牛卵母细胞，抑制了arf1活性，观察对牛卵母细胞第一次减数分裂的影响。本研究得到以下结论：arf1在牛卵母细胞成熟的各个时期都有较高水平的表达;其在第一次减数分裂中期(MⅠ)、后期(AⅠ)以及MⅡ期主要定位在纺锤体上;arf1或arf1MO抑制arf1活性导致纺锤体组装异常，不能正常的进行第一次减数分裂;用BFA处理后，纺锤体同样组装异常，此外部分牛卵母细胞不能形成纺锤体，只有微管组织。这说明arf1在牛卵母细胞第一次减数分裂纺锤体组装中起着重要作用。

关键词： arf1 纺锤体组装卵母细胞减数分裂牛

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华南忍冬arf1、TUA3以及AP4-μ基因克隆与功能验证

华南忍冬ARF1、TUA3以及AP4-μ基因克隆与功能验证

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作者：张云华中科技大学

学位级别：硕士

西南岩溶区分布在我国西南的8个省市,岩溶区水土流失导致石漠化严重,岩溶区石漠化问题现已成为中国西南最严重的生态地质环境问题。对岩溶区适生植物相关基因进行克隆,利用基因工程技术来培育能够适应岩溶区环境的植物是恢复岩溶区植被... 详细信息

西南岩溶区分布在我国西南的8个省市,岩溶区水土流失导致石漠化严重,岩溶区石漠化问题现已成为中国西南最严重的生态地质环境问题。对岩溶区适生植物相关基因进行克隆,利用基因工程技术来培育能够适应岩溶区环境的植物是恢复岩溶区植被的重要方法之一,从而对岩溶区石漠化进行修复。华南忍冬作为西南岩溶区典型的经济作物,能够很好的适应高钙的岩溶环境,克隆华南忍冬体内与钙转运相关的基因,通过基因转化来培育能够适应岩溶区环境的植物,这对于岩溶区石漠化修复具有重要意义。实验室前期利用不同浓度的高钙胁迫处理华南忍冬,通过Gene Fishing技术找到3个可能参与植物体内钙离子转运相关的基因片段。本文对这3个基因完整编码框进行克隆,并利用模式生物*** BL21及拟南芥对这3个基因进行功能分析。本文取得的主要结果如下:(1)首先,从华南忍冬叶片cDNA中获得arf1、TUA3和AP4-μ基因的完整编码框,并对三个基因进行了跨膜结构域、蛋白质二级结构、亚细胞定位等生物信息学分析。(2)分别构建了arf1、TUA3、AP4-μ基因与原核表达载体pET-28a的重组载体,并在*** BL21中进行了原核表达分析。结果表明,在高浓度Ca2+条件下,分别转入arf1、TUA3、AP4-μ基因的菌株与转入pET-28a空质粒菌株相比具有更短的生长迟滞期和较高的生物量。(3)分别构建了arf1、TUA3、AP4-μ基因与植物表达载体pBinGlyRed3-35S的重组载体,通过农杆菌介导转化模式植物拟南芥,并对转基因植株进行了阳性鉴定。对转基因拟南芥和野生型拟南芥进行高Ca2+胁迫处理结果表明,转TUA3基因拟南芥和转AP4-μ基因拟南芥耐钙性显著增强,而转入arf1基因对拟南芥的耐钙性影响不大。(4)分别测定了高钙胁迫条件下转基因拟南芥和野生型拟南芥的部分生理指标。结果表明,转TUA3基因拟南芥和转AP4-μ基因拟南芥通过维持细胞内正常水平的叶绿素含量、可溶性蛋白、可溶性糖含量以及维持较高水平的CAT活性,从而使细胞维持较高的细胞质浓度和清除细胞内多余的活性氧,这对于维持细胞内膜系统和酶系统的稳定性非常重要。

关键词：高钙环境华南忍冬 arf1 TUA3 AP4-μ 功能分析

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氧化应激对Hsp90α、arf1细胞内定位和相互作用的影响

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现代生物医学进展 2012年第12期12卷 2205-2208页

作者：马晓姣陈雪梅戴沛娟段丹萍邹飞南方医科大学公共卫生与热带医学院职业卫生与职业医学系广东广州510515

目的:探讨氧化应激对热休克蛋白90α(Hsp90α)与ADP-核糖基化因子1(arf1)细胞内定位、相互作用的影响。方法:应用500μM H2O2处理HepG2细胞,建立氧化应激模型,MTT比色法检测细胞活力,Western blotting检测Hsp90α和arf1水平,细胞免疫荧... 详细信息

目的:探讨氧化应激对热休克蛋白90α(Hsp90α)与ADP-核糖基化因子1(arf1)细胞内定位、相互作用的影响。方法:应用500μM H2O2处理HepG2细胞,建立氧化应激模型,MTT比色法检测细胞活力,Western blotting检测Hsp90α和arf1水平,细胞免疫荧光法、免疫共沉淀检测上述蛋白在氧化应激下的分布、共定位变化和相互作用。结果:MTT比色法结果提示,随氧化应激时间延长,细胞存活力降低;Western blotting结果显示,氧化应激可提高胞内Hsp90α和arf1蛋白水平;免疫共沉淀结果显示,随氧化应激作用时间延长,Hsp90α与arf1相互结合增多;细胞免疫荧光结果显示,随氧化应激作用时间延长,Hsp90α与arf1荧光强度增强,并趋于沿胞膜分布。结论:提示氧化应激影响Hsp90α和arf1的水平、胞内分布及相互作用。

关键词：氧化应激 Hsp90α arf1

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Functional analysis of a reproductive organ predominant expressing promoter in cotton plants

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Science China(Life Sciences) 2005年第5期48卷 452-459页

作者： REN Maozhi1,3 , CHEN Quanjia2 , LI Li1, ZHANG Rui1 & GUO Sandui1 1. Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China 2. Department of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Urumchi 830052, China 3. College of Life Science and Technology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, China 1. Biotechnology Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences 100081 Beijing China 2. College of Life Science and Technology Shanghai Jiao Tong University 200030 Shanghai China 3. Department of Agronomy Xinjiang Agricultural University 830052 Urumchi China

Transgenic Bt insect-resistant cotton plants have high insect resistance in the early stage of development, but relatively low resistance in the late stage. Substituting a reproductive organ-specific promoter for the CaMV35S promoter presently being used could be an ideal solu-tion. For the first time, the promoter sequence of ADP-ribosylation factor 1 (arf1) gene was iso-lated from Gossypium hirsutumY18 by means of inverse PCR. The sequencing result discovered the unique structure of the arf1 promoter, including four promoter-specific elements, the initiator, TATA box, CAAT box and GC box, and also an intron in 5′-untranslation region. Four plant ex-pression vectors were constructed for functional analysis of the promoter. Based on the pBI121 plant expression vector, four truncated arf1 promoters took the place of the CaMV35S promoter. These vectors were different only in their promoter regions. They were introduced into cotton plants via pollen tube pathway. Histochemical GUS staining and fluorescence quantitative analyses were performed to examine the expression patterns of the GUS gene driven by the 4 arf1 truncated promoters in transgenic cotton plants respectively. The results showed that the arf1 promoter was a typical reproductive organ-specific promoter. Hopefully, the arf1 promoter can be a regulatory element for designing cotton reproductive organs with desired characteris-tics.

关键词： cotton plant, arf1 promoter, reproductive organ, preferential expression, functional identification.

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Role of α-Tubulin Acetylation and Protein Kinase D2 Ser/Tyr Phosphorylation in Modulation by Ghrelin of Porphyromonas gingivalis-Induced Enhancement in Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Secretion by Salivary Gland Cells

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Journal of Biosciences and Medicines 2016年第7期4卷 82-94页

作者： Bronislaw L. Slomiany Amalia Slomiany Research Center Rutgers School of Dental Medicine Rutgers The State University of New Jersey Newark NJ USA

Matrix metalloproteinas-9 (MMP-9) is a glycosylated endopeptidase, and hence its processing between the endoplasmic reticulum (ER), Golgi and trans-Golgi (TGN) network remains under a strict control of factors that affect the microtubule (MT) stabilization, and the recruitment and activation of coat and cargo proteins, including ADP-ribosylation factors (arfs) and protein kinase D (PKD). Here, we report on the factors implicated in the regulation of MMP-9 secretion by salivary gland acinar cells in response to P. gingivalis LPS, and the effect of hormone, ghrelin. We show that the LPS-elicited induction in MMP-9 secretion is associated with the increase in α-tubulin acetylation and the enhancement in MT stabilization, while the modulatory effect of ghrelin is reflected in a decrease in α-tubulin acetylation. Further, the effect of the LPS occurs in concert with up-regulation in arf-guanine nucleotide exchange factor (GEF)-mediated arf1 activation and the TGN recruitment of PKD2, while ghrelin exerts the modulatory effect on arf-GEF activation. Moreover, we reveal that the LPS-induced up-regulation in MMP-9 secretion is reflected in a marked increase in PKCδ-mediated PKD2 phosphorylation on Ser, while the modulatory effect of ghrelin is manifested by the SFK-PTKs-dependent phosphorylation of PKD2 on Tyr. The findings demonstrate that MT stabilization along with arf-GEF-mediated arf1/PKD2 activation play a major role in P. gingivalis LPS-induced up-regulation in salivary gland acinar cell MMP-9 secretion, and point the modulatory mode of action by ghrelin.

关键词： Porphyromonas gingivalis Oral Mucosa Ghrelin MMP-9 α-Tubulin Acetylation arf1 PKD2 Ser/Tyr Phosphorylation

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两类猪ADP-核糖基化因子的克隆分析与原核表达载体构建

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河南师范大学学报（自然科学版） 2012年第4期40卷 103-106页

作者：朱岩昆余燕卢全伟吴世秀张建新马金友河南师范大学生命科学学院河南新乡453007 河南科技学院动物科学学院河南新乡453003 安阳工学院生物与食品工程学院河南安阳455000 河南科技学院动物病毒研究所河南新乡453003

哺乳动物小G结合蛋白——二磷酸腺苷-核糖基化因子(ADP-ribosylation factors,arfs)除在囊泡运输、细胞骨架重排和调节细胞吞噬等方面起重要作用外,还与病毒的感染有关.前期研究发现猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and re... 详细信息

哺乳动物小G结合蛋白——二磷酸腺苷-核糖基化因子(ADP-ribosylation factors,arfs)除在囊泡运输、细胞骨架重排和调节细胞吞噬等方面起重要作用外,还与病毒的感染有关.前期研究发现猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染早期arfs基因表达明显上调,然而在猪只中arfs与PRRSV的感染至今知之甚少.本研究中,猪arf1和arf4分别被克隆,序列分析发现:arf1包含一个长度为546bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF),预测编码181个氨基酸,理论分子质量为20.70kDa,pI为6.62;arf4包含一个长度为543bp的开放阅读框,预测编码180个氨基酸,理论分子质量为20.50kDa,pI为5.46.蛋白序列结构分析显示猪arf1和arf4蛋白含有典型的p loop,switch区,interswitch区和N端疏水区的Hasp,在第二位都含有可被肉豆蔻酰基化的甘氨酸.猪arf1和arf4的原核表达载体也被构建,为进一步研究其在PRRSV感染过程中的调控提供基础.

关键词： arf1 arf4 原核表达 PRRSV 猪

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PICK1通过MAPK信号通路的抗胶质瘤作用研究

PICK1通过MAPK信号通路的抗胶质瘤作用研究

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作者：沈京澜浙江省医学科学院

学位级别：硕士

目的:胶质瘤是一种在中枢神经系统(CNS)中高发的恶性肿瘤。世界卫生组织(WHO)根据胶质瘤恶性程度将其分为I-IV四个等级,胶质母细胞瘤属于最高级别的IV型胶质瘤。GBM拥有强大的迁移能力和浸润能力,术后患者常出现肿瘤复发和转移,五年存... 详细信息

目的:胶质瘤是一种在中枢神经系统(CNS)中高发的恶性肿瘤。世界卫生组织(WHO)根据胶质瘤恶性程度将其分为I-IV四个等级,胶质母细胞瘤属于最高级别的IV型胶质瘤。GBM拥有强大的迁移能力和浸润能力,术后患者常出现肿瘤复发和转移,五年存活率为5.8%。我国脑胶质瘤年发病率为5-8/10万,常见肿瘤中5年病死率仅次于胰腺癌和肺癌,因此寻找抗胶质瘤发展的靶点对于临床有效治疗胶质瘤来说十分迫切。已有研究证明,PICK1在胶质瘤中异常低表达与患者预后相关,但PICK1在胶质瘤中的作用机制仍不明确。因此,本文主要研究PICK1在胶质瘤中的作用机制,为临床治疗胶质瘤提供理论依据。方法:(1)通过对TCGA数据库进行分析,初步确定PICK1和arf1在人脑胶质瘤中的表达水平,并在收集的临床胶质瘤患者的肿瘤样本及胶质瘤细胞上进行验证。(2)使用过表达PICK1质粒转染胶质瘤细胞C6和U87,对细胞进行CCK-8实验,观察PICK1对胶质瘤细胞增殖能力的影响。(3)通过检测胶质瘤细胞的ATP和乳酸生成情况,以及胶质瘤细胞对葡萄糖的摄取能力,研究过表达PICK1后胶质瘤细胞C6和U87的糖代谢水平变化。(4)根据线粒体膜电位实验(JC-1),在荧光显微镜下观察过表达PICK1质粒后胶质瘤细胞的线粒体损伤情况,判断PICK1是否会对胶质瘤细胞的线粒体造成损伤。(5)进行Transwell迁移和细胞划痕实验,检测对照组细胞和过表达PICK1的胶质瘤细胞迁移能力的变化。(6)构建裸鼠皮下胶质母细胞瘤模型,收集对照组和过表达PICK1组的C6细胞,在裸鼠右侧肩胛骨部位进行皮下注射。每2天观察并记录裸鼠的皮下肿瘤生成情况。待皮下瘤生长到一定程度,处死裸鼠,解剖取出皮下瘤拍照并称重。评估PICK1对胶质瘤在体内发生发展的影响。(7)取对照组和过表达PICK1组裸鼠的肿瘤组织进行包埋切片,同时提取对照组和过表达PICK1组胶质瘤细胞的总蛋白,通过肿瘤免疫组化染色和蛋白免疫印迹实验检测PICK1过表达后对胶质瘤组织及胶质瘤细胞中arf1表达以及MAPK通路激活产生的影响。并通过Co-IP以及蛋白免疫印迹实验进一步探查PICK1与arf1之间的关系。结果:(1)TCGA和GTEx数据库分析结果显示,与正常脑组织相比,PICK1在胶质瘤中的表达量明显降低,并且其在高级别胶质瘤中的表达量降低的最为显著,与胶质瘤的恶性级别呈负相关性。在对胶质瘤患者样本及胶质瘤细胞的实验结果也验证了上述结果。结果具有统计学差异。(2)CCK-8结果表明,过表达PICK1可以有效抑制胶质瘤细胞的增殖活性。结果具有统计学差异。(3)过表达PICK1的胶质瘤细胞在产生ATP及摄取葡萄糖两方面均低于对照组(p0.05)。这些结果表明PICK1在一定程度上抑制了胶质瘤细胞的糖代谢活动。(4)据JC-1结果显示,PICK1表达上调后,JC-1单聚体(绿色荧光)明显增多,细胞线粒体的膜电位下降,表明PICK1会对胶质瘤细胞线粒体造成损伤。结果具有统计学差异。(5)Transwell迁移实验和细胞划痕实验结果表明,过表达PICK1后,胶质瘤细胞的迁移率与对照组细胞相比明显下降(p1抑制胶质瘤迁移能力。(6)动物实验数据表明,过表达PICK1组裸鼠的皮下肿瘤生长速度与对照组裸鼠相比显著降低,且过表达PICK1组裸鼠生成的胶质瘤在体积和重量上均显著低于对照组裸鼠(p1显著抑制胶质瘤体内成瘤。(7)胶质瘤免疫组化染色及胶质瘤蛋白免疫印迹实验结果表明:过表达PICK1后,arf1的表达及MAPK通路的P38、JNK、ERK1/2蛋白的磷酸化均受到了抑制(p1能够抑制arf1的表达,介导MAPK通路蛋白的磷酸化水平。Co-IP实验结果表示,在胶质瘤细胞中的PICK1与arf1能够相互结合。并且通过蛋白免疫印迹实验分析同样证实PICK1上调会抑制arf1表达(p1在胶质瘤中呈低表达,其过表达可有效抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移,并对线粒体造成损伤,抑制胶质瘤糖代谢。此外,在PICK1介导的胶质瘤作用机制研究中发现,PICK1可以与arf1结合并抑制arf1表达,进而抑制胶质瘤细胞中MAPK通路的激活,达到抗胶质瘤的目的。

关键词： PICK1 arf1 脑胶质瘤 MAPK通路

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小G蛋白在心肌钠通道蛋白转运中的作用

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福建医药杂志 2018年第6期40卷 114-118页

作者：张紫冠胡森陈文博黄峥嵘李卫华厦门大学附属第一医院心内科厦门大学医学院心律失常与心脏电生理实验室厦门361003

目的研究小G蛋白Sar1和arf1对钠通道蛋白(Nav1.5)转运的调控作用。方法以HEK293细胞作为宿主细胞,将人SCN5A基因转染到HEK293细胞中,通过G418筛选稳定表达SCN5A基因的细胞系;为了检测小G蛋白对Nav1.5的调节效应,野生型或突变型的小G蛋白... 详细信息

目的研究小G蛋白Sar1和arf1对钠通道蛋白(Nav1.5)转运的调控作用。方法以HEK293细胞作为宿主细胞,将人SCN5A基因转染到HEK293细胞中,通过G418筛选稳定表达SCN5A基因的细胞系;为了检测小G蛋白对Nav1.5的调节效应,野生型或突变型的小G蛋白Sar1和arf1分别瞬转到HEK293-Nav1.5细胞。利用免疫印迹对目标蛋白进行定量,应用免疫荧光对细胞内的目标蛋白进行定位。结果过表达突变的Sar1减少了细胞膜上Nav1.5的表达和抑制了Nav1.5转运到细胞膜上。另外,过表达arf1对于Nav1.5在细胞的表达及定位无明显影响。结论小G蛋白Sar1可能参与调节Nav1.5在细胞内的运输。

关键词：小G蛋白 Sar1 arf1 SCN5A基因 Nav1.5蛋白

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