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中国预防兽医学报 2020年第9期42卷 879-886页

作者：武珊珊敬文宪陈启伟李学瑞刘永生中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

为探究双组分系统arcb基因对鼠伤寒沙门氏菌耐药性的影响,本研究利用Red同源重组系统构建arcb基因缺失株和arcb基因回复株以及通过无缝克隆和重组技术构建3株arcb基因关键位点点突变株。采用微量稀释法测定亲本株、arcb缺失株、回复株... 详细信息

为探究双组分系统arcb基因对鼠伤寒沙门氏菌耐药性的影响,本研究利用Red同源重组系统构建arcb基因缺失株和arcb基因回复株以及通过无缝克隆和重组技术构建3株arcb基因关键位点点突变株。采用微量稀释法测定亲本株、arcb缺失株、回复株及点突变株药物敏感性和体外生长速率,初步分析双组分系统arcb基因对鼠伤寒沙门氏菌耐药性的影响。结果显示,经PCR测序鉴定结果表明构建了鼠伤寒沙门氏菌CVCC541Δarcb缺失株及其回复株、arcb基因点突变株(arcb^His-292-Ala、arcb^Asp-576-Ala、arcb^His-717-Ala)。生长曲线测定结果显示:缺失株、点突变株和亲本株相比生长速率降低,回复株生长速率回复,与亲本株生长曲线一致;MIC测定结果显示:与亲本株相比,arcb基因缺失株对β-内酰胺类、大环内酯类、四环素类、氯霉素类抗生素的敏感性无变化,但对氨基糖苷类的链霉素、阿米卡星、庆大霉素的耐药性分别增加16、8、4倍;基于该结果测定的各菌株对氨基糖苷类抗生素的MIC结果显示:与亲本株相比,arcb基因缺失株对链霉素、妥布霉素、庆大霉素的耐药性增加8倍,对阿米卡星、新霉素、奈替米星、卡那霉素的耐药性增加4倍,对大观霉素的敏感性未发生变化;而回复株与亲本株药物敏感性相似;arcb基因关键位点突变株的药物敏感性与arcb基因缺失株一致。以上结果表明,arcb基因参与鼠伤寒沙门氏菌对氨基糖苷类抗生素耐药性的调控。上述实验结果为深入研究双组分系统对鼠伤寒沙门氏菌的耐药机制提供实验依据。

关键词：鼠伤寒沙门氏菌双组分系统 arcb基因药物敏感性

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鼠伤寒沙门氏菌CVCC541耐药性双组分系统的筛选及功能研究

鼠伤寒沙门氏菌CVCC541耐药性双组分系统的筛选及功能研究

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作者：武珊珊中国农业科学院

学位级别：硕士

鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)是革兰氏阴性肠道杆菌,其引起的沙门氏菌病对人类健康及畜牧业、水产业的健康发展造成严重影响。近年来由于抗生素的滥用,造成的多药耐药现象极为严重,使沙门氏菌病的防治更加困难。细菌为了生... 详细信息

鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)是革兰氏阴性肠道杆菌,其引起的沙门氏菌病对人类健康及畜牧业、水产业的健康发展造成严重影响。近年来由于抗生素的滥用,造成的多药耐药现象极为严重,使沙门氏菌病的防治更加困难。细菌为了生存需要调控自身代谢来适应各种刺激,最主要的调控系统是双组分系统,该系统与细菌的多种生物学功能相关,是一种磷酸转移信号转导途径。已报道的沙门氏菌双组分系统有二十多种,本试验研究了ArcA/Arc B、KdbD/KdpE、RssA/RssB、BaeS/Bae R、PmrA/PmrB、Pho P/PhoQ、RstA/RstB、UvrY、NtrB、TtrS/TtrR、QseB/QseC、NarL/NarX、DcuS/DcuR、CreC/CreB、GlrR/GlrK、BarA/SirA和TorR系统,通过构建上述系统基因缺失株筛选调控鼠伤寒沙门氏菌CVCC541耐药性的双组分系统,以阐明各系统对沙门氏菌耐药性调控机制。本研究利用Red同源重组技术构建了鼠伤寒沙门氏菌CVCC541上述双组分系统基因缺失株,测定缺失株对抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。结果显示,经PCR鉴定和测序证实成功构建了鼠伤寒沙门氏菌CVCC541上述双组分系统基因缺失株。MIC试验结果表明,与亲本株相比,pmrA、pmrB基因缺失后对多粘菌素B的敏感性分别增加了8倍、16倍;phoP、phoQ基因缺失后对多粘菌素B的敏感性增加了8倍,对强力霉素的敏感性增加了4倍,phoQ缺失对青霉素G的敏感性增加了4倍;arcA、arcb基因缺失后对链霉素的耐药性分别增加了16倍和8倍,arcA缺失对新霉素耐药性增加了8倍,arcb缺失对阿米卡星的耐药性增加了8倍;creC基因缺失后对四环素的耐药性增加了8倍。通过上述试验结果可知调控耐药性的双组分系统有:PmrAB、Pho PQ、ArcAB及Cre CB系统,其中PmrAB、PhoPQ系统调控对多粘菌素类的耐药性,Arc AB系统调控对氨基糖苷类的耐药性,CreCB系统调控对四环素类的耐药性。目前关于Arc AB系统耐药性研究极少,且调控机制尚不清楚,对该系统arcA、arcb基因结构的解析表明,arcA基因的Asp56位点及arcb基因His292、Asp576、His717位点是其磷酸化信号转导的关键位点。本试验通过pSTV28质粒构建了回复株CVCC541?arcA/parcA、CVCC541?arcb/parcb,并通过无缝克隆和重组技术构建点突变回复株arcAAsp-56-Ala、arcbHis-292-Ala、arcbAsp-576-Ala、arcbHis-717-Ala。PCR鉴定和测序结果证实成功构建了回复株及点突变回复株。生物学特性研究结果显示:与亲本株相比,缺失株、点突变回复株生长速率降低,同时回复株生长速率与亲本株一致,表明该基因缺失后对CVCC541的生长有一定的影响;MIC结果显示CVCC541?arcA、CVCC541?arcb对氨基糖苷类药物敏感性有不同程度的降低;回复株均表现出与亲本株相似的药物敏感性;arcA、arcb基因关键位点突变后与arcA、arcb基因缺失对鼠伤寒沙门氏菌CVCC541氨基糖苷类药物耐药性的调控一致。研究表明,arcA、arcb基因确实通过磷酸化途径参与鼠伤寒沙门氏菌对氨基糖苷类抗生素的耐药调控。

关键词：鼠伤寒沙门氏菌双组分系统 arcA基因 arcb基因耐药性

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