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食品与发酵工业 2024年

作者：黄茜琳黄俊宝高旭丽罗雅妮陶伟郭明雨刘永圆吴超吴晶刘艳安徽工程大学生物与食品工程学院

为提高纳豆激酶的表达量，在不改变编码纳豆激酶的氨基酸序列前提，将aprn基因的N端编码序列（N-terminal coding sequences，NCSs）进行同义突变，构建包含突变序列的pHY-P43质粒，经转化和测序分别构建4株突变菌株NK1、NK2、NK3和NK4... 详细信息

为提高纳豆激酶的表达量，在不改变编码纳豆激酶的氨基酸序列前提，将aprn基因的N端编码序列（N-terminal coding sequences，NCSs）进行同义突变，构建包含突变序列的pHY-P43质粒，经转化和测序分别构建4株突变菌株NK1、NK2、NK3和NK4，纤维蛋白板检测纳豆激酶活力，利用SDS-PAGE验证，通过响应面优化发酵条件。结果表明，NK1、NK2、NK3、NK4菌株纳豆激酶活力分别为94.8、101.9、124.2、69.4 IU/mL。其中NK3菌株的酶活力最高，较原始菌株提高了50%；NK4菌株酶活力最低仅为原始菌株酶活力的83%。SDS-PAGE显示重组酶生产纳豆激酶的分子质量约为28 kDa，与理论的分子质量27 kDa相符。通过响应面分析得出优化后重组菌株NK3产纳豆激酶的最佳条件为：初始pH 7.56、发酵温度35 ℃、发酵时间38 h。纳豆激酶酶活力138.1 IU/mL，较未优化前提高11.2%。该研究为提高纳豆激酶活力提供一种新的策略，且不改变纳豆激酶本身的性质。

关键词：纳豆激酶 aprn基因 N端编码枯草芽孢杆菌同义突变

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纳豆激酶基因工程菌的构建及酶活力分析

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食品科学 2017年第14期38卷 1-8页

作者：崔青钱炳俊姚晓敏季顺利鲁飞凤吴静张建华上海交通大学农业与生物学院陆伯勋食品安全研究中心上海200240

纳豆激酶由纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)的aprn基因编码,在体内外具有很强的溶解纤维蛋白活性。利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增*** natto的aprn基因,并依据***的密码子偏好性优化了起始30个氨基... 详细信息

纳豆激酶由纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)的aprn基因编码,在体内外具有很强的溶解纤维蛋白活性。利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增*** natto的aprn基因,并依据***的密码子偏好性优化了起始30个氨基酸的密码子,构建了重组表达质粒pHT01-aprn。经限制性酶酶切、PCR扩增和测序验证了其编码的正确性。通过电击法将含有强启动子的pHT01-aprn导入***,利用氯霉素抗性筛选获得B.s 168/pHT01-aprn工程菌。经IPTG诱导表达,摇瓶发酵培养最高酶活力为(289.00±3.42)U/mL,是野生菌的3.9倍,酶活力表达稳定性良好。

关键词：纳豆激酶 aprn基因枯草芽孢杆菌基因工程菌酶活力

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来源于豆豉的枯草芽孢杆菌MX-6所产纳豆激酶的稳定性研究

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中国调味品 2019年第7期44卷 25-28,33页

作者：满丽莉向殿军内蒙古民族大学生命科学学院内蒙古通辽028042 内蒙古民族大学农学院内蒙古通辽028042

以中国豆豉中筛选到的1株纤溶酶高产菌株——枯草芽孢杆菌MX-6为研究对象,应用聚合酶链式反应(PCR)成功扩增到1473bp的纤溶酶编码基因aprn,系统进化树结果显示该纤溶酶为纳豆激酶。研究了纳豆激酶对热、pH、金属离子、化学物质、抑制剂... 详细信息

以中国豆豉中筛选到的1株纤溶酶高产菌株——枯草芽孢杆菌MX-6为研究对象,应用聚合酶链式反应(PCR)成功扩增到1473bp的纤溶酶编码基因aprn,系统进化树结果显示该纤溶酶为纳豆激酶。研究了纳豆激酶对热、pH、金属离子、化学物质、抑制剂和变性剂的稳定性及传代稳定性。结果表明:纳豆激酶在-20,4,30~50℃的热稳定性较好,pH在3~11之间酶活性相对稳定,Mg2+、Ca2+对纳豆激酶具有显著的激活作用,K+、Fe2+对纳豆激酶的稳定性基本无影响,而Mn2+、Zn2+、Cu2+、Al3+、Ba2+有显著的抑制作用,Hg2+导致纳豆激酶完全失活,牛血清蛋白、明胶、蛋白胨能够显著提高纳豆激酶的稳定性,丙二醇、海藻酸钠对纳豆激酶的稳定性基本无影响,而乙醇显著降低纳豆激酶的稳定性。PMSF导致纳豆激酶的活性完全丧失,EDAT和DTT对纳豆激酶的活性基本无影响,10mmol/L的SDS显著降低纳豆激酶的稳定性,说明此纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶,不是金属酶,不含二硫键,且具有良好的传代稳定性。结果显示该酶的稳定性较好,具有开发为溶栓药物的应用价值,有利于纳豆激酶的工业化应用。

关键词：纳豆激酶 aprn基因克隆枯草芽孢杆菌稳定性

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纳豆激酶基因克隆及在大肠杆菌与粟酒裂殖酵母中的表达

纳豆激酶基因克隆及在大肠杆菌与粟酒裂殖酵母中的表达

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作者：王伟安徽农业大学

学位级别：硕士

纳豆是一种日本传统的发酵产品,纳豆中的纳豆激酶(NK)是一种枯草芽孢杆菌蛋白激酶,可口服吸收,溶解血栓,溶栓效率高;相比传统的尿激酶和链激酶等药物,有快速溶解血栓、半衰期长、副作用小等优点。因此纳豆激酶是一种具有巨大开发潜力的... 详细信息

纳豆是一种日本传统的发酵产品,纳豆中的纳豆激酶(NK)是一种枯草芽孢杆菌蛋白激酶,可口服吸收,溶解血栓,溶栓效率高;相比传统的尿激酶和链激酶等药物,有快速溶解血栓、半衰期长、副作用小等优点。因此纳豆激酶是一种具有巨大开发潜力的食源性溶栓药物,引起医药及食品研究领域的广泛关注。纳豆激酶基因(aprn)全长1146bp,包含一个完整编码阅读框,编码381个氨基酸,前29个氨基酸残基组成信号肽序列(signal peptide),后跟一段77个氨基酸残基组成的前导肽(propeptide)和275个氨基酸残基组成的成熟肽(mature peptide),根据aprn基因序列和质粒pET28a的性质,设计引物,优化PCR条件,确认最佳反应条件为：94℃预变性2min,94℃变性30s,退火温度55℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环后,72℃延伸10min。在此条件下,从纳豆杆菌克隆到高特异性的aprn基因。将PCR产物成功克隆至表达载体pET28a上,经双酶切鉴定,证明克隆到pET28a载体上的基因即为aprn基因。将重组质粒pET28a-aprn进行双酶切验证后转入*** BL21(DE3)中,对重组菌的生长规律进行研究,aprn基因的导入对宿主细胞没有明显影响。重组菌的诱导表达研究表明：20℃下培养、IPTG添加量为0.4mmol/L、培养20h时表达产物的纤溶活性最大,可达至81.73U/mL, SDS-PAGE检测观察到一条38KD的蛋白条带,与预期相符。为了进一步提高外源基因的稳定性及表达量,将aprn基因克隆到粟酒裂殖酵母S. pombe yAS56中进行研究。首先根据aprn基因和质粒pESP-2的性质重新设计引物,探索PCR反应条件,得到特异性带较好的aprn基因片段,成功构建重组质粒pESP-2-aprn,转入大肠杆菌DH10B中,经过双酶切鉴定,证明克隆至pESP-2质粒上的外源基因即为aprn基因。采用醋酸锂转化法将重组质粒pESP-2-aprn转入yAS56中,在选择性培养基中进行筛选培养。对转化子进行菌落PCR,结果证明外源基因已导入酵母细胞中。通过纤维蛋白平板法检测发现,细胞破碎液上清中发现有纤溶活性,但活性较低,细胞培养上清液中没有发现纤溶活性。SDS-PAGE检测表明：细胞破碎液中发现一条明显与预期蛋白相符的条带,细胞上清液中没有此条带,说明目的蛋白在胞内表达,没有分泌至胞外。

关键词： aprn基因克隆表达大肠杆菌粟酒裂殖酵母

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纳豆激酶基因工程菌的构建及高密度发酵

纳豆激酶基因工程菌的构建及高密度发酵

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作者：崔青上海交通大学

学位级别：硕士

血栓引起的发病率和死亡率的比重越来越高,溶栓剂是治疗的最有效药物,但当前临床使用的溶栓剂都存在一些缺点,溶栓剂仍需要不断被开发和改进,尤其是预防性的食源性的溶栓剂很有必要。纳豆激酶(nattokinase,NK)最早来自日本传统食品纳豆... 详细信息

血栓引起的发病率和死亡率的比重越来越高,溶栓剂是治疗的最有效药物,但当前临床使用的溶栓剂都存在一些缺点,溶栓剂仍需要不断被开发和改进,尤其是预防性的食源性的溶栓剂很有必要。纳豆激酶(nattokinase,NK)最早来自日本传统食品纳豆中,是由纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶,由aprn基因编码。作为新型溶栓剂的代表,NK无免疫原性,不仅溶栓效果显著且安全无毒,正成为一种具有开发和利用价值的功能性食品。生产NK的传统方式为固态发酵,尽管产量较高,但NK分离纯化步骤繁琐、酶活损失严重;采用基因工程菌液体发酵又可能存在产生包涵体、酶活性低的问题。为提高NK的产量,本研究主要内容如下:(1)利用PCR技术扩增*** natto的aprn基因,并依据枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的密码子偏好性优化了起始30个氨基酸的密码子,添加六个组氨酸片段便于纯化,构建了重组表达质粒pHT01-aprn1。经限制性酶酶切、PCR扩增和测序验证了其序列的正确性。通过电击法将含有强启动子的pHT01-aprn1导入*** 168,利用氯霉素抗性筛选获得*** 168/pHT01-aprn1工程菌。(2)探究IPTG和2,6-吡啶二羧酸用量、诱导温度、培养基浓度和接种量对酶活的影响,经摇瓶培养,采用四肽底物法检测最高酶活为289 U/mL(RSD%=1.1),酶活表达稳定性良好,是野生菌的3.9倍。用镍柱纯化发酵上清液,经SDS-PAGE和Western-Blot验证得到电泳纯NK。(3)为实现工业化生产,进行补料发酵实验,酶活达到4521.78IU/mL(RSD%=1.2),进一步优化补料方案,酶活达7778.5 IU/mL(RSD%=1.1)。发酵液经硫酸铵沉淀的酶活回收率为89.02%。冷冻干燥蛋白浓缩液后经镍柱纯化,酶活回收率为93.78%。纯化液经脱盐、冻干后,酶活为20000 FU/mL标准品的4.07倍。

关键词：纳豆激酶 aprn基因基因工程菌酶活高密度发酵

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