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apob100调控Nrf2通路在骨关节炎中加重软骨损伤研究

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ApoB100调控Nrf2通路在骨关节炎中加重软骨损伤研究

作者：程逸凡山东大学

学位级别：硕士

研究目的:骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是中老年人最常见的骨关节退行性疾病,主要病理表现为软骨的进行性损伤。目前普遍认为,OA发病与年龄、炎症、肥胖、软骨损伤和遗传等多种因素有关,其中肥胖和软骨损伤是非常重要的独立危险因素,涉... 详细信息

研究目的:骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是中老年人最常见的骨关节退行性疾病,主要病理表现为软骨的进行性损伤。目前普遍认为,OA发病与年龄、炎症、肥胖、软骨损伤和遗传等多种因素有关,其中肥胖和软骨损伤是非常重要的独立危险因素,涉及多种作用方式、炎症因子及信号通路。近年来,在脂代谢研究领域apob100作为明星分子炙手可热。患有动脉粥样硬化、心肌梗塞、高脂蛋白血症、糖尿病等疾病的患者常伴有血清apob100升高。因此,如果能研究apob100在骨关节炎中的作用,探讨其与OA发病相关的机制并以其作为治疗靶点,可对防治骨关节炎提供新思路,对应用于临床转化、生产研发新药物奠定新理论基础,可参与救治与日俱增的广大OA患者,意义重大。研究方法:1.原代软骨细胞的分离与培养在无菌操作台中,从1周龄C57BL/6J小鼠的膝关节中提取原代软骨细胞,培养基为含有1%青霉素链霉素双抗及10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,培养条件为37℃,5%二氧化碳。实验采用第二代软骨细胞。***100与Nrf2在原代软骨细胞核内定位在荧光显微镜下观察apob100、Nrf2在软骨细胞中的定位,探讨其可能关系。3.骨关节炎细胞模型建立与探究IL-1β与apob100对原代软骨细胞活性的影响在本实验中,通过向原代软骨细胞中加入IL-1β建立骨关节炎细胞模型,并通过CCK-8法检测IL-1β与apob100对于原代软骨细胞的活性影响。4.探究apob100对原代软骨细胞的作用通过阿利新蓝染色鉴定各组原代软骨细胞软骨活性;通过Westren blot实验检测apob100对原代软骨细胞中软骨相关基因Sox-9、Collagen Ⅱ、Collagen X、MMP13的作用影响;通过qRT-PCR实验检测apob100对原代软骨细胞中Nrf2相关抗氧化应激基因的作用影响;通过DCFH-DA探针实验检测细胞内ROS含量变化。实验结果:***-1β与apob100对原代软骨细胞活性影响结果(1)不同浓度的IL-1β(5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml)作用于原代软骨细胞,CCK-8法检测药物作用48h时各组的细胞活力。结果显示,IL-1β对原代软骨细胞活性无明显影响。(2)不同浓度的apob100(2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml)作用于原代软骨细胞,CCK-8法检测药物作用48h时各组的细胞活力。结果显示,apob100对原代软骨细胞活性无明显影响。***100对原代软骨细胞表型的作用结果(1)阿利新蓝染色结果显示,原代软骨细胞对照组染色阳性显著、炎症组(IL-1β)染色阳性减弱、apob100组染色阳性显著、实验组(IL-1β+apob100)染色阳性进一步减弱。(2)Westren blot实验结果显示,相比于原代软骨细胞对照组,单纯炎症模型组(IL-1β)Sox-9、Collagen Ⅱ、Aggrecan 表达降低,MMP13 蛋白表达升高;实验组(IL-1β+apob 100)Sox-9、Collagen Ⅱ、Aggrecan 表达进一步降低,MMP13蛋白表达进一步升高。相比于原代软骨细胞对照组与单纯炎症模型组(IL-1β),实验组(IL-1β+apob100)Nrf2表达降低,Keap1表达升高。(3)qRT-PCR实验结果显示,相比于原代软骨细胞单纯炎症模型组(IL-1β),实验组(IL-1β+apob 100)Cu/Zn Sod、Mn Sod、Catalase、Thioredoxin-1、Thioredoxin-2、Peroxiredoxin-1、Peroxiredoxin-4、NQO1 mRNA 表达显著降低。(4)DCFH-DA探针实验结果显示,在荧光显微镜下,实验组(IL-1β+apob100)细胞内ROS表达量明显高于其余各组。结论:本研究探讨了脂代谢相关分子apob100在原代软骨细胞中的作用,研究显示,apob100对原代软骨细胞生长增殖无明显影响。apob100在炎症状态下会降低软骨细胞中酸性黏蛋白表达,使阿利新蓝染色减弱,同时降低软骨相关基因Sox-9、Collagen Ⅱ、Aggrecan表达,增高软骨降解基因MMP13表达,并破坏Nrf2相关抗氧化应激通路,降低Nrf2表达,提高Keap1表达,并降低该通路下游相关基因的mRNA表达,增加细胞内ROS含量。这些结果表明脂代谢相关分子apob100在OA中具有加重炎症的作用,并会抑制Nrf2抗氧化应激通通路。阐明了OA、软骨细胞、apob100之间可能存在的作用关系,并对以apob100作为靶点研究预防、治疗骨关节炎的新型药物,提供了新思路与理论基础,在骨关节炎的防治中具有重要意义。

关键词： apob100 骨关节炎 Nrf2 原代软骨细胞 IL-1β

奶牛apob100基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

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黑龙江畜牧兽医 2013年第9期 15-17,21页

作者：王力张加力杨文涛丁红研张仁和王哲李小兵赵权吉林农业大学动物科学技术学院长春130118 吉林大学畜牧兽医学院长春130062

为了进一步研究apob100在肝脏脂肪代谢中的功能,试验采用构建pET-28a-apob100表达质粒的方法对其进行研究。结果表明:用IPTG成功诱导表达出apob100蛋白,并且获得了高效价多克隆抗体。说明表达质粒pET-28a-apob100构建成功。

关键词： apob100 基因克隆多克隆抗体

2,2’-盐酸脒基丙烷对apob100的氧化作用

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武汉大学学报（医学版） 2004年第3期25卷 236-238,248页

作者：王贞喻红洪嘉玲李小明武汉大学医学院生物化学与分子生物学系武汉430071

目的 :探讨载脂蛋白B1 0 0 (apob1 0 0 )的体外氧化状态与其基本性质变化之间的关系。方法 :采用多聚阴离子沉淀、短时密度梯度超速离心法得到纯化的低密度脂蛋白 (LDL) ,经有机试剂抽提脂质 ,由半制备型分子排阻型高效液相色谱进一步... 详细信息

目的 :探讨载脂蛋白B1 0 0 (apob1 0 0 )的体外氧化状态与其基本性质变化之间的关系。方法 :采用多聚阴离子沉淀、短时密度梯度超速离心法得到纯化的低密度脂蛋白 (LDL) ,经有机试剂抽提脂质 ,由半制备型分子排阻型高效液相色谱进一步纯化得到apob1 0 0。 2 ,2’ 盐酸脒基丙烷 (AAPH)氧化apob1 0 0 ,经反相高效液相色谱分析其疏水性质。结果 :体外轻微氧化apob1 0 0不会导致其降解 ,但其疏水性会增强。结论 :AAPH氧化apob1 0 0所致的早期疏水性改变 ,可能与LDL被清道夫受体识别有关。

关键词：低密度脂蛋白 apob100 氧化自由基疏水性

奶牛apob100基因的原核表达及多克隆抗体的制备

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奶牛ApoB100基因的原核表达及多克隆抗体的制备

作者：王力吉林农业大学

学位级别：硕士

奶牛载脂蛋白B100(apob100)是目前所知道的蛋白分子量最大的蛋白质之一,它含有4536个氨基酸残基,是组成极低密度脂蛋白(VLDL)颗粒结构的多肽链,是VLDL中的甘油三酯(TG)结合蛋白,如果没有apob100,肝脏中的TG是不可能分泌的。apob100在肝... 详细信息

奶牛载脂蛋白B100(apob100)是目前所知道的蛋白分子量最大的蛋白质之一,它含有4536个氨基酸残基,是组成极低密度脂蛋白(VLDL)颗粒结构的多肽链,是VLDL中的甘油三酯(TG)结合蛋白,如果没有apob100,肝脏中的TG是不可能分泌的。apob100在肝脏中的功能是增加VLDL的组装、分泌、减少肝脏中的脂肪沉积,对脂肪肝的发生起到有效防治。VLDL颗粒的组装和分泌受肝脏中apob100基因表达和apob100的生物活性控制,apob100的生物活性和基因表达水平对VLDL在肝脏中组装和分泌起到关键作用。VLDL在肝脏的合成和TG转运出肝脏的速度直接受到apob100合成及正常应用的影响。apob100作为VLDL的最主要的载脂蛋白和结构蛋白,主要是参与VLDL、低密度脂蛋白(LDL)的组装和分泌。apob100在肝脏中的确切机制仍然不是很清楚,可能受到营养和激素等因素的调节。本实验采用基因工程等分子生物学技术对apob100基因进行了克隆和表达,获得大量apob100蛋白,并对表达出的apob100蛋白进行了纯化、复性、免疫试验动物。根据GenBank中收录的apob100基因序列设计引物、扩增序列,并对扩增序列测序分析和比对,获得目的基因747bp,与GenBank中收录的牛载脂蛋白B基因的编码序列完全一致,同源性为100%,再将目的基因与表达载体分别用EcoRI和BamHI双酶切后连接,构建奶牛载脂蛋白B基因表达质粒pET-28a-apob100。在大肠杆菌中成功表达了蛋白apob100。本实验摸索和优化了两个关键表达条件：诱导表达时的IPTG浓度、诱导时间。当菌体密度OD600值约为1.0时加入0.4mg/mL的IPTG诱导表达3.0h的表达效果最佳。将纯化复性所得蛋白免疫大白兔,获得抗apob100的多克隆抗体,为开展apob100分子后续功能的研究及对奶牛营养代谢性疾病如常见的奶牛酮病和奶牛脂肪肝提供了前期理论研究基础。本实验的研究目的是建立体外高效表达apob100的方法,获得纯度较高的apob100蛋白。用所表达蛋白免疫动物获得多克隆抗体,为进一步研究其在奶牛脂肪肝、酮病等营养代谢性疾病的生物学功能奠定基础。

关键词： apob100 原核表达多克隆抗体

大鼠NALFD与胰岛素抵抗、高血压病及apob100水平关系的探讨

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大鼠NALFD与胰岛素抵抗、高血压病及ApoB100水平关系的探讨

作者：张景益郑州大学

学位级别：硕士

1背景与目的非酒精性脂肪肝的概念（NAFLD）范围较广，涉及到脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎（NASH），被认为最常见的慢性肝脏疾病。NAFLD是代谢综合征(MS)的组成成分，是心血管疾病的危险因素。它主要病理改变是肝脏脂肪堆积，但最终... 详细信息

1背景与目的非酒精性脂肪肝的概念（NAFLD）范围较广，涉及到脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎（NASH），被认为最常见的慢性肝脏疾病。NAFLD是代谢综合征(MS)的组成成分，是心血管疾病的危险因素。它主要病理改变是肝脏脂肪堆积，但最终会导致肝硬化，甚至可能进展为肝细胞癌，因此，NAFLD也可以被视为一个癌症的危险因素。鉴于NAFLD不断升高的发病率以及带来的不良后果，临床上不断提高其认识及诊治水平显得十分重要。NALFD的临床诊断主要靠彩超检查，但其受操作者经验及标准的把握等主观因素影响很大。血脂中的TG、LDL-C由于受多因素影响且稳定性差也不能作为评价NALFD严重程度的良好指标。本研究用高脂、高糖饲喂制备大鼠NALFD模型，评价肝脏组织NALFD的严重程度，试图阐明载脂蛋白B100（apob100）、胰岛素抵抗、高血压与NALFD的关系，为非酒精性脂肪肝的诊治提供理论依据。单硝酸异山梨酯是常用的扩张冠状动脉血管的药物，临床上，冠心病和高血压病常合并存在，该研究同时亦观察了单硝酸对高血压及非高血压者血脂、血糖等指标的影响。2方法2.1分组及饲料分配实验大鼠包括自发高血压大鼠（SHR大鼠）和Wistar大鼠，分别用S和W表示。随机分为普通饮食组（普食W、普食S）和高脂组（高脂W、高脂S）和单硝酸异山梨酯干预组（单硝W、单硝S）。普通饮食组喂食常规饲料，高脂组喂高脂、高糖饲料加生理盐水灌喂，单硝组喂高脂高糖饲料加单硝酸异山梨酯灌喂干预。2.2观察时间及指标喂养12周后测各组的体重变化、apob100、血清甘油三脂(TG)、血清胆固醇(TC)。行IVGTT和IVIRT，并根据结果计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。脂肪肝严重程度依据肝组织HE染色后光镜下观察，所得NALFD活动度积分确定。2.3统计学分析使用SPSS软件分析apob100、TG、TC、HOMA-IR与脂肪肝严重程度的关系,以及单硝酸干预对血脂、HOMA-IR以及NAFLD的影响。3结果3.112周后，同种大鼠比较，高脂及单硝组的HOMA-IR、TG、TC、FIN、apob100均高于普食喂养组，差异有统计学意义(papob100与NAFLD严重程度的相关性较高（r值为0.918，p值为0.010），高于TC（r值为0.903，p值为0.014）、LDL-C（r值为0.871，p值为0.024）、HOMA-IR（r值为0.812，p值为0.033）与NAFLD的相关性。4结论4.1经高脂、高糖饲喂12周后，Wistar大鼠和SHR大鼠均出现IR。HOMA-IR与脂肪肝严重程度正相关;4.2SHR大鼠较Wistar大鼠更易发生NAFLD;4.3大鼠apob100水平与NAFLD严重程度正相关;4.4单硝酸异山梨酯灌喂加重SHR大鼠NAFLD的严重程度而对Wistar大鼠没有明显影响，原因未明。

关键词：非酒精性脂肪肝胰岛素抵抗 apob100 IVGTT IVIRT 高血压病

apob100基因第26号外显子6694bp处MspⅠ位点突变与高血脂相关性

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放射免疫学杂志 2008年第6期21卷 594-597页

作者：陈奇奥孙敏沙姗姗徐永成大连市第三人民医院 116037

目的:载脂蛋白B100(apob100)是血浆中低密度脂蛋白(LDL)的组成成分,可与组织中LDL受体结合并介导LDL的降解和清除,此功能对于维持血清中LDL和胆固醇水平的稳定起重要作用。apob100的一些基因突变将明显影响apob100的结构和功能,导致血浆... 详细信息

目的:载脂蛋白B100(apob100)是血浆中低密度脂蛋白(LDL)的组成成分,可与组织中LDL受体结合并介导LDL的降解和清除,此功能对于维持血清中LDL和胆固醇水平的稳定起重要作用。apob100的一些基因突变将明显影响apob100的结构和功能,导致血浆中LDL降解受阻,血浆中LDL和胆固醇含量升高从而增加其它心血管疾病的风险。本文将探讨apob100基因第26号外显子6694bp处的基因突变所致的MspⅠ位点多态性与高血脂之间的关系。方法:本文采用KI法提取50例高血脂症患者、60例对照组人群外周血细胞基因组DNA,设计并合成PCR引物,利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)分析其apob100基因第26号外显子6694bp处MspⅠ位点的基因型。结果:高血脂组基因型分布为M(+)M(+):42例,M(+)M(-):7例,M(-)M(-):1例;对照组基因型分布为M(+)M(+):59例,M(+)M(-):1例,M(-)M(-):0例。统计分析表明高血脂组与对照组之间基因型分布有明显差异(Papob100基因第26号外显子6694bp处MspⅠ位点突变与高血脂相关。

关键词： apob100 Msp I位点多态性高血脂 PCR-RFLP方法

急性脑血管病与APoA1、apob100及比值的关系

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中国临床神经科学 2001年第4期9卷 389-390页

作者：张云霞张惠丽王宏李晓军王玉华石河子大学医学院附院神经科 832008 石河子市开发区医院

病例选择全部观察对象来自1999年1月～2000年3月的神经科住院病人236例.诊断标准参考全国第二次脑血管病会议标准.均经头CT或MRI证实临床诊断.

关键词：急性脑血管病 APoA1 apob100 比值

血脂、apob100、Lp(a)及oxLDL对ASCVD的辅助诊断价值探讨

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上海医学检验杂志 1997年第1期12卷 27-28页

作者：王华梁孔宪涛陈思聪张国元上海长征医院 200003

本文测定了90例ASCVD患者和120例对照的血脂、apob100、Lp（a）和oxLDL，以探讨它们对ASCVD的辅助诊断价值．结果表明：对于ASCVD的实验室检查，oxLDL（834±379μg／L对对照组的442±193和446±215μg／L，P＜0．001）可能在特异性和... 详细信息

本文测定了90例ASCVD患者和120例对照的血脂、apob100、Lp（a）和oxLDL，以探讨它们对ASCVD的辅助诊断价值．结果表明：对于ASCVD的实验室检查，oxLDL（834±379μg／L对对照组的442±193和446±215μg／L，P＜0．001）可能在特异性和敏感性方面优于其他项目，apob100亦有显著差异，而LP（a）则是反映遗传背景的一个较好的指标．在常规血脂检测中，HDL-C／TC比值有一定价值．

关键词：血脂 oxLDL apob100 ASCVD 血脂过高冠心病

应用全自动生化分析仪测定载脂蛋白APOAI和apob100

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江西医学检验 1995年第2期13卷 26-27页

作者：牟秀萍江医二附院检验科 330006