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双重结合肽段协助胞内蛋白酶体系统降解alpha-突触核蛋白

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中国生物化学与分子生物学报 2021年第12期37卷 1675-1681页

作者：郝梦娇任晓曦陈茜邓邺云张建亮首都医科大学基础医学院神经生物学系北京100069

alpha-突触核蛋白(alpha-synuclein,α-syn)异常累积与聚集是帕金森病的重要致病因素之一。目前,已有的降低细胞内α-syn的方法多是从抑制新蛋白质合成角度进行,而无法干预已经存在并产生毒性的蛋白质。该研究旨在探索一种可以降解α-sy... 详细信息

alpha-突触核蛋白(alpha-synuclein,α-syn)异常累积与聚集是帕金森病的重要致病因素之一。目前,已有的降低细胞内α-syn的方法多是从抑制新蛋白质合成角度进行,而无法干预已经存在并产生毒性的蛋白质。该研究旨在探索一种可以降解α-syn的新方法,从而挽救α-syn造成的细胞损伤。本研究依据Trim-Away方法设计了2种针对α-syn降解的肽段,即Pep1和Pep2,并将其过表达至HEK293T以及SH-SY5Y细胞中。Western印迹检测和免疫荧光分析以及免疫共沉淀结果表明,Pep1和Pep2可以在上述细胞系中表达,并与α-syn形成复合物,协助胞内蛋白酶体系统降解α-syn(P蛋白酶体系统降解α-syn,并缓解α-syn造成的细胞损伤。本研究为短肽的研发、应用以及帕金森病的干预提供新的思路。

关键词： alpha-突触核蛋白 Trim-Away 肽段帕金森病蛋白酶体

alpha-突触核蛋白寡聚体致帕金森病小鼠模型的行为学变化

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中国老年学杂志 2016年第21期36卷 5227-5230页

作者：王鹏历春王海鹏盖晓东北华大学基础医学院人体解剖学教研室吉林吉林132013 北华大学基础医学院病理学教研室

目的观察家族型帕金森病(PD)alpha-突触核蛋白(α-Syn)突变体A53T和A30P寡聚体导致小鼠PD模型的行为学变化,探讨α-Syn寡聚体在体内的神经毒性作用。方法制备野生型α-Syn、家族型突变体A53T和A30P的聚集体,对C57BL/6小鼠进行纹状体注... 详细信息

目的观察家族型帕金森病(PD)alpha-突触核蛋白(α-Syn)突变体A53T和A30P寡聚体导致小鼠PD模型的行为学变化,探讨α-Syn寡聚体在体内的神经毒性作用。方法制备野生型α-Syn、家族型突变体A53T和A30P的聚集体,对C57BL/6小鼠进行纹状体注射。培养至第30、60天,进行爬杆实验、悬吊实验、滚轴实验和平衡木实验评估行为学改变。免疫组织化学方法检测黑质多巴胺能神经元改变。结果实验鼠纹状体α-Syn寡聚体注射后30 d出现PD样运动障碍表现,纹状体注射30 d和60 d后,各组小鼠的爬杆实验结果均与对照组无差异(P>0.05)。注射30 d后,野生型α-Syn寡聚体组小鼠平衡木实验、悬挂实验、滚轴实验与对照组无差异(P>0.05);A53T和A30P组小鼠平衡木时间比对照组长(P<0.05),滚轴上时间比对照组小鼠缩短(P<0.05),悬挂评分比对照组明显降低(P<0.01),与野生型α-Syn寡聚体组相比有统计学差异(P<0.05)。注射60 d后,野生型α-Syn寡聚体组小鼠平衡木实验平均通过时间比对照组小鼠长(P<0.05)、悬挂实验评分较对照组小鼠降低(P<0.05);A53T和A30P组小鼠各项行为学评估与对照组小鼠差异显著(P<0.01)、与野生型α-Syn寡聚体组相比有差异(P<0.05)。A53T和A30P组小鼠黑质多巴胺能神经元数目下降(P<0.05)。结论纹状体注射α-Syn突变体A53T和A30P寡聚体,模型小鼠出现PD样行为学改变和黑质多巴胺能神经元减少。

关键词：帕金森病 alpha-突触核蛋白寡聚体

alpha-突触核蛋白与完整线粒体相互作用的NMR研究

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波谱学杂志 2021年第2期38卷 164-172页

作者：余锦波张偲张则婷徐国华李从刚中国科学院生物磁共振分析重点实验室波谱与原子分子物理国家重点实验室(中国科学院精密测量科学与技术创新研究院)湖北武汉430071 中国科学院大学北京100049

天然无结构蛋白alphα-突触核蛋白(α-synuclein)能影响线粒体的形态、动力学及损害线粒体正常功能,被认为是帕金森症的致病机制之一.α-synuclein与线粒体模拟膜及分离提取的完整线粒体的相互作用研究是理解该蛋白如何影响线粒体的有... 详细信息

天然无结构蛋白alphα-突触核蛋白(α-synuclein)能影响线粒体的形态、动力学及损害线粒体正常功能,被认为是帕金森症的致病机制之一.α-synuclein与线粒体模拟膜及分离提取的完整线粒体的相互作用研究是理解该蛋白如何影响线粒体的有效途径.文献报道α-synuclein能与磷脂模拟的线粒体内膜相互作用却不与模拟的外膜相互作用,且N端在与线粒体的结合中扮演重要角色,但具体的作用位点仍不十分清楚.本文利用核磁共振(NMR)方法研究了α-synuclein与大鼠肝脏中分离的完整线粒体的相互作用,发现α-synuclein能与线粒体外膜相互作用,且作用区域位于α-synucleinN端的前60个氨基酸残基.这一结果与文献报道并不相同,可能是因为α-synuclein与线粒体外膜的作用不仅依赖于膜组分,可能也和膜的曲率或膜上其他组分等相关,而这些是模拟膜所不易体现的.同时,我们的研究也证实NMR是研究蛋白质与分离完整线粒体相互作用的有效方法.

关键词：核磁共振(NMR) alpha-突触核蛋白完整线粒体相互作用

慢性鱼藤酮小鼠模型中铁与alpha-突触核蛋白分布的相关性研究

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慢性鱼藤酮小鼠模型中铁与alpha-突触核蛋白分布的相关性研究

作者：马希珍青岛大学

学位级别：硕士

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的神经退行性疾病,其主要病理特征包括中脑黑质(substantia nigra,SN)多巴胺能神经元的选择性缺失,残存的神经元内出现以alpha-突触核蛋白(alpha-synuclein,α-syn)为主要成分的嗜酸性包涵... 详细信息

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的神经退行性疾病,其主要病理特征包括中脑黑质(substantia nigra,SN)多巴胺能神经元的选择性缺失,残存的神经元内出现以alpha-突触核蛋白(alpha-synuclein,α-syn)为主要成分的嗜酸性包涵体即路易小体(Lewy bodies,LBs)。Braak分级学说认为LBs的病理改变是一个从低位脑到高位脑的渐变过程。其典型的临床表现包括:静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿势反射障碍等。而在运动症状出现之前,PD病人常出现嗅觉功能障碍、便秘、焦虑、体位性低血压等非运动症状。基于PD病人和PD动物模型的大量研究发现,PD病理情况下SN区铁水平明显增高,α-syn异常聚集往往伴有铁的沉积。铁能够促进α-syn聚集,而α-syn作为铁代谢相关蛋白也影响铁的沉积。LBs中的α-syn 90%以上都以磷酸化形式存在,磷酸化修饰后的α-syn可能更易聚集。为阐明铁沉积与磷酸化alpha-突触核蛋白(phosphorylated alpha-synuclein,phos-α-syn)之间的分布关系。本实验用12月龄C57BL/6雄性小鼠,给予鱼藤酮灌胃1周、2周、3周、1月、2月、3月,并分别设立独立的溶剂对照组。通过Perl’s铁染色法,检测小鼠脑内不同脑区铁含量的变化。应用免疫组织化学染色的方法观察了小鼠各脑区phos-α-syn的分布规律。通过旷场实验、鼠尾血压测量、嗅觉实验、转棒实验测定小鼠焦虑程度、自主神经系统功能、嗅觉灵敏度、运动协调能力的改变。结果如下:1.鱼藤酮灌胃处理组与溶剂对照组相比,小鼠的SN及纹状体(striatum,Str)区在2周组至3月组铁阳性细胞计数均出现了明显的增加,差别有统计学意义(P0.05,n=5-6)。2.鱼藤酮灌胃处理组与溶剂对照组相比,小鼠SN、Str及OB区2周至3月组phos-α-syn表达增加,差别有统计学意义(P0.05,n=5-6)。3.鱼藤酮灌胃处理组与溶剂对照组相比,2周至6周小鼠体重明显下降,差别有统计学意义(P0.05,n=11-16)。6.鱼藤酮灌胃处理组与溶剂对照组相比,3周组至3月组小鼠的嗅觉功能明显降低,差别有统计学意义(P<0.05,n=11-16)。7.鱼藤酮灌胃处理组与溶剂对照组相比,2月组至3月组小鼠的运动协调能力明显降低,差别有统计学意义(P<0.05,n=11-15)。综上所述,鱼藤酮引起的铁含量变化按时间顺序依次为:SN和Str,OB,LC及V,最后是DMV、RP、Fr A和Te A。小鼠脑内phos-α-syn阳性细胞计数的增加按时间顺序依次为:SN、Str及OB,DMV、RP及LC,最后是Fr A、Te A和V。铁在SN-Str系统中沉积出现的时间较早,不晚于phos-α-syn表达的增加。鱼藤酮能够使小鼠的体重在2周至6周明显下降,SBP、DBP在2周时降低,HR在1月时加快,嗅觉功能在3周至3月组出现损伤、

关键词：帕金森病铁 alpha-突触核蛋白鱼藤酮

铁诱导alpha-突触核蛋白聚集的机制研究

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铁诱导alpha-突触核蛋白聚集的机制研究

作者：李文静青岛大学

学位级别：硕士

帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,以肌强直、肢体震颤和运动减少等症状为主要临床表现。其主要病理特征为黑质(substantia nigra, SN)多巴胺(dopamine, DA)能神经元的缺失和细胞内路易小体(Lewy b... 详细信息

帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,以肌强直、肢体震颤和运动减少等症状为主要临床表现。其主要病理特征为黑质(substantia nigra, SN)多巴胺(dopamine, DA)能神经元的缺失和细胞内路易小体(Lewy bodies, LBs)的形成。我国65岁以上的人群PD的患病率为1.7%,随着我国社会经济的发展和老龄化社会的加剧,PD的发病率势必进一步攀升。但是由于该病的确切病因和发病机制尚不清楚,使之无法从根本上预防和治疗PD并延缓其进展,因此,深入探讨PD的发病机制无疑对推动PD的防治具有重要的科学意义。铁在PD的发病过程中起着关键的作用,过量的游离铁,特别是Fe2+可以通过Fenton反应形成羟自由基(hydroxyl radical, OH·),而Fe3+则可以通过Haber-Weiss循环还原成Fe2+进而生成OH.。OH·通过损伤蛋白质、核酸、和含有大量未饱和脂肪酸的细胞膜,最终导致细胞死亡。目前已有大量证据表明alpha-突触核蛋白在PD的发病机制中起到重要的作用。alpha-突触核蛋白的过量表达可以导致其聚集体的形成并对细胞产生毒性。神经病理学研究发现以alpha-突触核蛋白异常聚集为主要病理变化的多种突触蛋白病往往伴有铁的堆积,说明铁与alpha-突触核蛋白聚集之间存在一定联系。另有实验证实Fe2+和Fe3+可在体外及细胞内促进alpha-突触核蛋白的聚集。最近,人们在alpha-突触核蛋白的5'端未翻译区(untranslated region, UTR)发现了类铁反应元件(iron responsive element, IRE),这一发现为铁可能通过增加alpha-突触核蛋白的表达导致DA能神经元的死亡提供了依据。为了探讨铁诱导alpha-突触核蛋白聚集的机制,本实验应用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法,流式细胞术(flow cytometry, FCM),硫磺素S和荧光双标记,逆转录多聚酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)及免疫印迹等多种实验方法,在SK-N-SH神经母细胞瘤细胞中观察抗氧化剂维生素E(vitamin E, VE)对铁诱导的细胞损伤和alpha-突触核蛋白聚集情况的变化,探讨铁诱导的氧化应激与alpha-突触核蛋白聚集之间的关系;构建含有alpha-突触核蛋白mRNA 5'-UTR类IRE的质粒alpha-synuclein-IRE-Luc,应用双荧光素酶检测(dual Iuciferase reporter assay)的方法在HEK293细胞中探讨其是否是功能性的铁反应元件,并在SK-N-SH细胞中证实铁可以通过铁调节蛋白(iron regulatory proteins, IRPs)-IRE系统调节alpha-突触核蛋白的表达。结果如下：1、1 mmol/L Fe2+和Fe3+处理SK-N-SH细胞24 h,细胞存活率下降,细胞内活性氧物质(reactive oxygen species, ROS)生成增加,与对照组相比差别有统计学意义(Palpha-突触核蛋白的聚集较对照组明显增多;2、5μmol/L VE与1 mmol/L Fe2+或1 mmol/L Fe3+共孵育SK-N-SH细胞24 h可以完全抑制铁诱导的ROS生成和细胞存活率的下降;5μmol/L VE能部分但不能完全阻断细胞内alpha-突触核蛋白聚集,提示氧化应激部分参与了铁诱导的alpha-突触核蛋白聚集;3、成功构建了携带alpha-突触核蛋白mRNA 5'-UTR类IRE的alpha-synuclein-IRE-Luc荧光素酶报告载体,应用双荧光素酶检测系统在HEK293细胞中检测插入的类IRE在转录后水平上的调节;同时构建了携带Ferroportinl mRNA 5'-UTR IRE的Ferroportin 1-IRE-Luc荧光素酶报告载体作为阳性对照;4、1 mmol/LFe3+孵育HEK293细胞可使alpha-synuclein-IRE-Luc转染组荧光素酶的表达上调,与阴性对照组相比差别有统计学意义(Palpha-synuclein-IRE-Luc转染组荧光素酶的表达下调,与阴性对照组相比差别有统计学意义(Palpha-synuclein-IRE-Luc共转染HEK293细胞,降低细胞内IRP

关键词：帕金森病 alpha-突触核蛋白铁氧化应激铁反应元件

alpha-突触核蛋白基因敲除对黑质铁代谢的影响及机制研究

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Alpha-突触核蛋白基因敲除对黑质铁代谢的影响及机制研究

作者：薛波青岛大学

学位级别：硕士

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的中老年人神经系统退行性疾病,主要的病理特征是黑质区(substantia nigra,SN)多巴胺(dopamine,DA)能神经元的选择性丢失,最终导致纹状体(striatum,str)区DA耗竭。PD的发病机制主要包括有... 详细信息

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的中老年人神经系统退行性疾病,主要的病理特征是黑质区(substantia nigra,SN)多巴胺(dopamine,DA)能神经元的选择性丢失,最终导致纹状体(striatum,str)区DA耗竭。PD的发病机制主要包括有氧化应激,SN铁异常沉积,炎症,异常蛋白聚集,凋亡和线粒体功能障碍等。随着社会老龄化的进一步发展,PD已经继老年痴呆后成为神经系统疾病的第二大杀手,虽然PD是一种慢性疾病没有急性致死效应,但是其严重影响了患者的生活质量,给家庭和社会带来了沉重的负担。alpha-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)是一种中枢系统大量表达的可溶性蛋白质,它与PD的发病机制和相关功能障碍密切相关,是路易小体(lewy bodies,LBs)的主要成分,最近研究发现α-syn是一种高铁还原酶,能将Fe3+还原成Fe2+。铁的细胞毒性在PD发病和进程中的起着关键作用,脑内高铁引起的氧化应激反应会导致SN-Str系统DA能神经元的死亡。研究还发现,在PD模型小鼠SN区,负责神经元铁转入作用的二价金属转运蛋白1(divalent metal transporter 1,DMT1)的表达增加。据此,我们推测:在SN区,α-syn与DMT1协同作用参与了细胞内铁的转入。为了探究α-syn基因敲除(α-synuclein knock out,KO)小鼠SN高铁还原酶活性的变化情况以及其对SN铁代谢的影响,我们用酶标仪来检测KO小鼠SN区α-syn高铁还原酶活性的改变,利用ICP-MS和铁染色技术检测KO小鼠中脑SN总铁的变化和Fe2+/Fe3+变化,同时,利用蛋白质免疫印记实验检测SN区DMT1和TH蛋白表达变化,观察KO小鼠能否抵抗铁对SN区DA神经元的损伤。在离体实验中,我们应用基因沉默的技术在SH-SY5Y细胞沉默α-syn基因,从细胞水平验证所上述结果,以及在活细胞状态下运用激光共聚焦显微镜检测SH-SY5Y的摄取铁的过程如何受到影响。结果如下:1.用含3%羰基铁粉的鼠粮喂养小鼠3个月,无论是正常饮食组还是高铁饮食组,KO组与WT组相比,DMT1蛋白表达水平显著降低(P蛋白表达无明显变化(P>0.05,n=6)。2.通过ICP-MS检测发现,在WT中,高铁饮食组中总铁显著高于正常饮食组(P0.05,n=6);用高铁鼠粮喂养时,总铁含量WT组显著高于KO组(P0.05,n=6)。3.WT组中,高铁饮食组与正常饮食组相比,Fe2+和Fe3+显著升高(P0.05,n=6);高铁饮食喂养时,WT组Fe2+和Fe3+显著高于KO组(P0.05,n=6)。WT组中,高铁饮食组与正常饮食组相比,Fe2+/Fe3+显著升高(P0.05,n=6);高铁饮食喂养时,WT组Fe2+/Fe3+显著高于KO组(P0.05,n=6)。4.组间比较发现,不同组高铁还原酶活性存在差异(P蛋白表达下降(P0.05,n=6);正常鼠粮喂养时,KO组与WT组相比,TH蛋白显著下降(P蛋白显著下降(P蛋白水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05,n=6)。8.慢病毒沉默SH-SY5Y细胞α-syn基因72h以后,我们应用钙黄绿素作为的指示剂,活细胞状态下加入1 mmol/L Fe SO4,检测细胞铁摄取情况。实验组与对照组相比,荧光强度变化较慢,结果有统计学意义(P<0.05,n=6)。随时间延长,不同时间点荧光强度

关键词：帕金森病多巴胺能神经元 alpha-突触核蛋白高铁还原酶铁

alpha-突触核蛋白对小鼠SN及VTA区铁代谢的影响研究

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Alpha-突触核蛋白对小鼠SN及VTA区铁代谢的影响研究

作者：沈情情青岛大学

学位级别：硕士

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的主要病理特征为中脑黑质(substantia nigra,SN)区多巴胺(dopamine,DA)能神经元丢失,残存神经元内出现以alpha-突触核蛋白(alpha-synuclein,α-syn)为主要成分的路易小体(Lewy bodies,LBs),纹状体(striatum,Str)区DA释放减少。其主要临床表现有运动症状,包括:震颤麻痹、肌僵直、运动迟缓和姿势反射障碍等,大多数的PD病人还会伴有焦虑、抑郁、嗅觉障碍和便秘等非运动症状。通常非运动症状的出现会早于运动症状几年甚至十几年。虽然炎症、蛋白质异常聚集、SN区铁沉积、线粒体功能障碍、氧化应激和凋亡等均与PD发病有关,但确切发病原因与机制尚不完全清楚。因此,确定PD的病因,研究出相应的防治策略,对治疗PD或延缓PD的进程显得尤为重要。α-syn是由140个氨基酸组成并广泛存在于突触前神经元中。研究表明,α-syn能够促进DA的合成、参与囊泡的形成与转运以及神经递质稳态与释放的调节等。另外,异常聚集与突变的α-syn参与了PD的发病,α-syn也是第一个发现的与PD发病有关的蛋白。研究发现,α-syn的异常聚集通常伴随着铁的沉积。本实验室前期研究已证实SN区铁含量的升高能够造成DA能神经元的死亡,铁能够加速α-syn的聚集。二价金属离子转运蛋白(divalent metaltransporter 1,DMT1)是铁转入蛋白,而铁转运蛋白1(ferroportin 1,FPN1)是目前已知的唯一的跨膜铁转出蛋白。SN区铁含量的增高与DMT1蛋白表达的升高和FPN1蛋白表达的降低有关,同时,DMT1和FPN1蛋白表达的变化受铁调节蛋白1(iron regulatory protein 1,IRP1)的调控。PD病人中DA能神经元的缺失主要发生在SN区,而DA能神经元同样富集的腹侧中脑被盖区(ventral tegmental area,VTA)却无明显变化。本实验室在PD小鼠模型中发现,铁沉积特异性出现在SN区而VTA区并无铁沉积,α-syn聚集体出现在SN区而VTA区未见α-syn聚集体。为探究在体状态下α-syn对SN和VTA区铁代谢的影响,我们利用腺相关病毒介导的α-syn分别注射到小鼠的SN和VTA区,4周后通过酶联免疫吸附测定、蛋白质免疫印迹实验、免疫组织化学和免疫荧光实验检测小鼠SN、Str和VTA区α-syn含量和酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)表达的变化,利用Perls’铁染色技术检测SN和VTA区铁阳性细胞数目的变化,通过电感耦合等离子体质谱技术(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)检测小鼠SN和Str区总铁含量的变化,通过爬杆测试检测小鼠运动速度的变化,转棒测试检测小鼠运动协调能力的改变,通过旷场测试分别检测小鼠自发运动总距离的变化和小鼠焦虑程度的变化。实验结果如下:(一)SN区过表达α-syn实验结果1.小鼠SN区注射α-syn 4周后,与对照组相比,α-syn组小鼠SN区人源α-syn含量增加,差异有统计学意义(P蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P蛋白表达水平显著增加,差异有统计学意义(P蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P蛋白表达上升,差异有统计学意义(P蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.05,

关键词：帕金森病 alpha-突触核蛋白铁黑质中脑腹侧被盖

铁导致的alpha-突触核蛋白聚集在帕金森病中的作用研究

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铁导致的alpha-突触核蛋白聚集在帕金森病中的作用研究

作者：和青青岛大学

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帕金森病(Parkinson's disease, PD)是继阿尔茨海默病之后的第二大神经系统退行性疾病。在我国,65岁以上的人群帕金森病的患病率为1.7%。PD的神经病理学基础是黑质(substantia nigra, SN)致密带多巴胺(dopamine, DA)能神经元的变性脱失... 详细信息

帕金森病(Parkinson's disease, PD)是继阿尔茨海默病之后的第二大神经系统退行性疾病。在我国,65岁以上的人群帕金森病的患病率为1.7%。PD的神经病理学基础是黑质(substantia nigra, SN)致密带多巴胺(dopamine, DA)能神经元的变性脱失以及由此而导致的纹状体DA含量降低。帕金森病的特征性病理结构是路易小体,其主要成分是聚集的alpha-突触核蛋白,另外还有铁,蛋白酶体亚单位,泛素,热休克蛋白等成分。在家族性或散发性帕金森病中,中脑黑质内的alpha-突触核蛋白mRNA水平均有增高。这些结果提示alpha-突触核蛋白与上述路易小体内的成分相互作用可能参与了多巴胺能神经元的选择性死亡。越来越多的证据表明铁在PD的发病中是一个关键因素,PD病人黑质变性的神经元内均发现铁含量的增高与路易小体的形成。近年来人们发现铁能够促进alpha-突触核蛋白的聚集,但具体机制还不清楚。血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1, HO-1)作为热休克蛋白32,存在于路易小体中。近来的研究发现,细胞内过表达HO-1能够通过激活泛素-蛋白酶体系统而促进alpha-突触核蛋白的降解。在HO-1基因编码区的启动子内存在激活蛋白-1(activtor protein-1,AP-1)序列,被称作抗氧化应激元件(antioxidant responses elements, ARE),它能够受到具有氧化还原活性的核转录因子(NF-E2-regulated factor 2,Nrf2)的精密调节。已证实Nrf2/HO-1途径是细胞内抗氧化应激的一条重要途径。那么在铁引起的alpha-突触核蛋白聚集过程中是否有Nrf2/HO-1途径的参与呢?本实验中,我们运用Fe3+或具有氧化还原活性的Fe2+作用于SK-N-SH细胞,运用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)法,流式细胞术、PCR、小干涉RNA、硫磺素S染色以及电镜等技术,探讨铁导致alpha-突触核蛋白的聚集及其毒性反应机制。结果发现：1.细胞内过表达alpha-突触核蛋白对SK-N-SH细胞存活率没有明显的影响,而干涉掉alpha-突触核蛋白48h后细胞存活率下降10%。与对照组相比,在过表达alpha-突触核蛋白的细胞中,Fe3+(100μmol/L,500μmol/L,1 mmol/L,10 mmol/L)孵育24 h进一步加重了细胞内高铁导致的细胞存活率下降,而同样浓度的Fe3+孵育干涉掉alpha-突触核蛋白的细胞则可阻断存活率的下降。2.Fe2+(100μmol/L)孵育过表达alpha-突触核蛋白的SK-N-SH细胞4h或Fe3+(100μmol/L,1 mmol/L)孵育24 h,与对照组相比,细胞内线粒体跨膜电位差(mitochondrial transmembrane potential, AΔΨm)的下降及活性氧物质(reactive oxygen species, ROS)生成的增多更为明显,而同样浓度的Fe2+或Fe3+孵育干涉掉alpha-突触核蛋白的细胞则可恢复ΔΨm以及抑制ROS的产生3.Fe2+(100μmol/L)孵育过表达alpha-突触核蛋白的SK-N-SH细胞4 h,能够加重Fe2+引起的细胞凋亡,表现为与对照组相比,Bcl-2 mRNA的下调更为明显和电镜观察到凋亡小体的出现,而Fe2+孵育干涉掉alpha-突触核蛋白的细胞未出现细胞凋亡4.Fe2+(100μmol/L)孵育过表达alpha-突触核蛋白的SK-N-SH细胞4h或Fe3+(100μmol/L,1 mmol/L)孵育24 h,细胞内出现明显的聚集。电镜下可见聚集形成的纤维丝以及受损肿胀的线粒体。同样浓度的Fe2+或Fe3+孵育干涉掉alpha-突触核蛋白的细胞未出现聚集。5.Fe2+(100μmol/L)孵育SK-N-SH细胞24 h能够引起Nrf2和HO-1 mRNA表达含量的时间依赖性变化。6.Fe2+(100μmol/L)孵育SK-N-SH细胞4h能够下调Nrf2和HO-1 mRNA含量,细胞内过表达alpha-突触核蛋白加重了Nrf2和HO-1 mRNA含量的下调,而细胞内干涉掉alpha-突触核蛋白则可使Nrf2和HO-1 mRNA含量恢复至正常水平。7.SK-N-SH细胞内过表达HO-1能够促进alpha-突触核蛋白mRNA的降解。上述结果表明,铁可以降低细胞ΔΨm、产生过多的ROS及诱导细胞凋亡产生细胞毒性。同时,铁可以通过下调Nrf2和HO-1 mRNA表达水平引起细胞内alpha-突触核蛋白的聚集,聚集的alpha-突触核蛋白又可以进一步加重Nrf2和HO-1 mRNA水平

关键词：铁 alpha-突触核蛋白 HO-1 Nrf2 帕金森病

携带人突变型alpha-突触核蛋白(A53T)帕金森病转基因小鼠运动功能及胃肠功能的评价研究

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携带人突变型alpha-突触核蛋白(A53T)帕金森病转基因小鼠运动功能...

作者：赵晨阳青岛大学

学位级别：硕士

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,在60岁以上的人群中患病率达到2%,随着年龄的增加,其发病率逐年增长。PD的主要病理特征为中脑黑质(substantia nigra,SN)多巴胺(dopamine,DA)能神经元选择性丢失... 详细信息

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,在60岁以上的人群中患病率达到2%,随着年龄的增加,其发病率逐年增长。PD的主要病理特征为中脑黑质(substantia nigra,SN)多巴胺(dopamine,DA)能神经元选择性丢失,纹状体DA含量减少,残存的DA能神经元内出现路易小体,其主要成分为聚集的alpha-突触核蛋白。Braak提出PD脑内病理进展的六级分级学说在国际上已被广泛接受,他指出黑质病变可能已经是PD发生的中期或中晚期(第三或第四阶段),故临床上通过运动症状改变而诊断的PD病人已经到达疾病的中晚期阶段。研究表明,对于散发性PD病人,在出现运动症状之前,98.6%的病人会出现一些非运动症状,包括嗅觉障碍,便秘,睡眠障碍,心血管功能障碍等。PD的非运动系统症状越来越受到研究者的关注。其中,胃肠道功能障碍的发生率是PD非运动症状中最高的,可达80%以上,尤其是胃排空延迟,在PD病人中的发生率高达70%-100%。本实验在携带人突变型alpha-突触核蛋白(A53T)的PD转基因动物模型上,观察了疾病进展过程中,小鼠运动行为和胃肠功能的变化,以期评价胃肠功能和运动行为发生改变的时间,并为进一步阐明PD中胃肠道功能障碍的中枢机制奠定基础。本实验在PD转基因小鼠上,在不同年龄阶段,应用旋转棒法检测了运动协调能力的改变,免疫荧光技术观察中脑SN内DA能神经元数量的改变,应用胃排空和小肠推进等不同方法,测定小鼠胃肠功能的变化。结果如下:1.A53T PD转基因小鼠基因型鉴定:A53T+/-与野生型小鼠杂交,后代阳性转基因小鼠在248 bp处有明显的条带,与目的基因alpha-突触核蛋白c DNA片段的预期位置相符,证实人突变型alpha-突触核蛋白基因已整合到小鼠基因组,并可以稳定传代。2.在A53T PD转基因雌鼠中,23-24月龄组小鼠在旋转棒上的停留时间降低了75%,与对照组相比,差别有统计学意义(Palpha-突触核蛋白(A53T)PD转基因小鼠中,雄鼠的发病年龄要早于雌鼠,伴随着SN DA能神经元数目的降低,动物会出现运动协调能力的降低,而在运动症状出现之前,PD转基因动物就会出现胃肠动力的改变。本研究提示,在PD早期,在出现运动症状之前,可能会出现非运动症状,如胃肠功能障碍,而这些功能障碍有可能会作为PD早期诊断和早期干预的靶点,但PD早期胃肠道功能障碍的机制尚需进一步探讨。

关键词：帕金森病 alpha-突触核蛋白多巴胺能神经元胃肠功能障碍运动协调