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中国媒介生物学及控制杂志 2023年第5期34卷 589-595页

作者：傅菁文刘文娟张忠张瑞玲山东第一医科大学(山东省医学科学院)临床与基础医学院山东济南250000 山东第一医科大学(山东省医学科学院)实验动物学院(省实验动物中心) 山东济南250000

目的探讨miR-276-3p在白纹伊蚊幼虫几丁质代谢中的作用,为实现利用几丁质代谢相关miRNA防控白纹伊蚊提供新的靶标。方法合成miR-276-3p特异性模拟物agomir和抑制剂antagomir的壳聚糖纳米颗粒,通过饲喂法过表达或抑制白纹伊蚊幼虫体内miR... 详细信息

目的探讨miR-276-3p在白纹伊蚊幼虫几丁质代谢中的作用,为实现利用几丁质代谢相关miRNA防控白纹伊蚊提供新的靶标。方法合成miR-276-3p特异性模拟物agomir和抑制剂antagomir的壳聚糖纳米颗粒,通过饲喂法过表达或抑制白纹伊蚊幼虫体内miR-276-3p的表达。利用反转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测幼蚊体内miR-276-3p的相对表达量,利用生化分析法测定幼蚊及蛹的几丁质含量变化,并统计幼蚊存活率、化蛹率及蛹的羽化率。表达量差异比较使用two-way方差分析,几丁质含量两组间比较使用t检验,存活率差异分析采用乘积极限法的log-rank检验和Mantel-Cox检验。结果miR-276-3p agomir壳聚糖纳米颗粒可有效过表达白纹伊蚊幼虫体内miR-276-3p的表达量,第1和第3天后表达量较对照分别上调73.96%(F=932.401,Pagomir壳聚糖纳米颗粒可有效抑制miR-276-3p的表达,第1和第5天后表达量较对照分别下调13.42%(F=293.632,P<0.001)和1.49%(F=69.542,P=0.014);过表达miR-276-3p导致幼虫几丁质含量上升了25.34%(t=85.838,P=0.019),幼虫存活率下降,第8天较对照组差异有统计学意义(χ^(2)=77.490,P=0.020),化蛹率为70.00%,低于对照组的90.00%;抑制miR-276-3p表达导致白纹伊蚊幼虫与蛹的几丁质含量分别下降了40.06%(t=71.811,P=0.028)和46.82%(t=92.147,P=0.011)。结论miR-276-3p对于白纹伊蚊幼虫的几丁质含量、存活率及化蛹率存在显著影响,相关研究结果为利用miRNAs调控白纹伊蚊幼虫的几丁质代谢,进而实现蚊虫防控提供了基础资料。

关键词：白纹伊蚊 agomir Antagomir miR-276-3p 饲喂

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褐飞虱鞘脂质代谢酶microRNA的鉴定及其功能研究

褐飞虱鞘脂质代谢酶microRNA的鉴定及其功能研究

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作者：朱晴子浙江大学

学位级别：硕士

褐飞虱Nilaparvata lugens Stal是水稻重要害虫,主要取食水稻韧皮部,造成叶片叶绿素减少,根部腐烂,植株发黄形成“虱烧”,稻飞虱还能传播多种水稻病毒,不仅造成水稻产量损失,更危害生态环境的健康持续发展。MicroRNA(miRNA)是新近发现... 详细信息

褐飞虱Nilaparvata lugens Stal是水稻重要害虫,主要取食水稻韧皮部,造成叶片叶绿素减少,根部腐烂,植株发黄形成“虱烧”,稻飞虱还能传播多种水稻病毒,不仅造成水稻产量损失,更危害生态环境的健康持续发展。MicroRNA(miRNA)是新近发现并引起广泛关注的一类非编码小RNA分子,能调控靶基因,引起靶基因的翻译抑制或mRNA降解,通过本研究我们鉴定了十种miRNAs,并对其中两条进行了相关的功能研究。1.通过Stem-loop RT-PCR验证miR-279、miR-106-5p、miR-162-3p、 miR-184-3p、miR-20-5p、miR-222-3p、miR-226-3p、miR-30-5p、miR-33-5p、 mir-60-5p十种miRNA,检测其分别在褐飞虱各个时期的表达量。2.用miRNA功能分析工具miR antagomir和miR agomir对miR-279和miR-184-3p进行抑制和过表达。并对预测到的靶基因SMS和SMPD4的进行检测。结果表明miR-279能调控SMS的转录水平。而miR-184-3p对SMPD4的转录没有影响。3.用HPLC-MS测定经miR antagomir和miR agomir处理后的褐飞虱体内鞘脂质组分和含量。发现经antagomir-279或agomir-184-3p处理后,褐飞虱体内鞘磷脂、神经酰胺和其他几种鞘脂质的含量升高,褐飞虱体重下降。经agomir-279或antagomir-184-3p处理后,褐飞虱体内鞘磷脂、神经酰胺和其他几种鞘脂质的含量降低,褐飞虱体重无明显变化。4.本文通过直接的证据表明miR-279能调控SMS的转录水平,间接的证据表明miR-279能调控SMS的翻译水平,因而SMS是miR-279的靶基因。而未直接证实SMPD4是miR-184-3p的靶基因,但SMPD4的翻译可能受到miR-184-3p的调控。

关键词： miRNA miR-279 miR-184-3p antagomir agomir 靶基因鞘脂质

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家蚕幼虫蜕皮期microRNA的鉴定及miR-282-5p的功能研究

家蚕幼虫蜕皮期microRNA的鉴定及miR-282-5p的功能研究

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作者：赖娟重庆大学

学位级别：硕士

昆虫的表皮(即昆虫的外骨骼)是由蜡质层和几丁质层组成的。表皮细胞分泌的外骨骼一经硬化后,就不能继续扩大,从而使昆虫生长受到限制。因此,昆虫在生长发育过程中会出现蜕皮现象,即将旧表皮蜕去,形成新表皮的过程。蜕皮是昆虫生长发育... 详细信息

昆虫的表皮(即昆虫的外骨骼)是由蜡质层和几丁质层组成的。表皮细胞分泌的外骨骼一经硬化后,就不能继续扩大,从而使昆虫生长受到限制。因此,昆虫在生长发育过程中会出现蜕皮现象,即将旧表皮蜕去,形成新表皮的过程。蜕皮是昆虫生长发育的基本生理现象,主要受蜕皮激素诱导。蜕皮激素是昆虫体内最为重要的两类激素之一。在昆虫蜕皮期,蜕皮激素浓度呈现由低到高再降低的趋势,这种浓度的改变会激活不同的蜕皮激素响应因子,调控不同靶基因的表达,从而控制昆虫的蜕皮进程。因此,蜕皮激素信号转导通路随着激素浓度波动所发生的改变对昆虫蜕皮进程的正常进行是十分关键的。然而,我们对于该通路中的调控因子还有待进一步研究。microRNA(miRNA)是一类能够发挥转录后调控功能的内源单链RNA分子,广泛参与生物体内的生长发育和生理调控等重要的生命进程。然而,miRNA是否参与了昆虫的蜕皮进程以及如何与蜕皮激素信号转导通路相互关联的仍然不清楚。如前所述,在昆虫蜕皮时,蜕皮激素滴度呈现波动,本文关注于激素滴度开始降低时,即蜕皮进程中后期,miRNA在其中的功能。首先通过高通量测序鉴定出在此过程中表达的miRNA,再分析出miRNA的差异表达模式,并对20-羟基蜕皮素(20-hydroxyecdysone,20E)介导的miRNA进行功能探究。主要研究结果如下:(1)在家蚕幼虫体内蜕皮激素刚开始下降时,注射20E以延长激素作用时间。在处理后的6小时以及12小时时取表皮材料用于miRNA测序。基于miRBase数据库,利用miRDeep2在已测数据中共鉴定出323个已知的miRNA和174个新的miRNA。对鉴定出的miRNA进行差异表达分析,得到了8个受20E调控的差异表达miRNA,我们对其中差异最为显著的miR-282-5p进行了下一步的研究。(2)使用RNAhybrid、pita、miranda和Targetspy四种靶基因软件预测miR-282-5p调控的靶基因。对预测的靶基因进行NR功能注释、GO功能富集以及KEGG通路富集。GO功能富集分析显示miR-282-5p靶基因主要为NADH脱氢酶(泛醌)活性、网格蛋白适配器复合物、Arp2/3复合物介导的肌动蛋白成核;KEGG富集则主要富集在代谢途径和剪接体这两条基因通路上。对预测的靶基因进行NR功能注释发现几丁质酶前体KWMTBOMO03966和转录因子MSTRG.4173是miR-282-5p的靶基因。(3)通过双荧光素酶基因报告实验验证miR-282-5p对靶基因KWMTBOMO03966和MSTRG.4173的靶向调控关系,荧光活性结果表明miR-282-5p靶向KWMTBOMO03966的编码区和MSTRG.4173的3’UTR区,且miR-282-5p对两个靶基因的表达都是抑制作用。(4)为验证miR-282-5p在幼虫蜕皮过程中的作用,在3龄幼虫蜕皮时期气孔指数为B时注射miR-282-5p agomir,以提高幼虫体内miR-282-5p的水平。通过miRNA与靶基因之间的定量结果显示,miR-282-5p能够抑制靶基因KWMTBOMO03966和MSTRG.4173的表达,这与双荧光素酶基因报告实验结果一致。但是注射agomir表皮切片的HE染色和几丁质染色结果并未显示与对照相比明显的差别,也并未观察到注射agomir后的家蚕存在蜕皮异常的现象。我们推测,可能是由于注射agomir后两个靶基因表达水平的降低仅约50%,而这种程度的降低不足以引起家蚕蜕皮时期的表型。还有一种可能是存在着功能的冗余,家蚕体内存在着一种补偿机制弥补了异常的miR-282-5p表达所带来的影响。例如,靶基因KWMTBOMO03966,它是几丁质酶前体,而家蚕体内有4种形式的几丁质酶,存在其它形式的几丁质酶弥补了KWMTBOMO03966表达降低所带来的影响。综述所述,在4龄家蚕蜕皮期间受20E介导的差异表达miRNA有8个,其中差异最为显著的是miR-282-5p。miR-282-5p会显著抑制靶基因几丁质酶前体KWMTBOMO03966和转录因子MSTRG.4173的表达,这为研究miR-282-5p的功能提供了基础。但注射miR-282-5p agomir后并未观测到任何表型。因此,miR-282-5p的功能还需要进一步的深入探究,这将帮助我们认识20E影响的miRNA对家蚕蜕皮的生理调控机制。

关键词：家蚕 microRNA 20-羟基蜕皮素 agomir miR-282-5p

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miRNA-146a靶向干预改善晚期APP/PS1双转基因模型小鼠认知功能的实验研究

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广东医科大学学报 2020年第2期38卷 142-147,152页

作者：麦晖范炜豪陈雄金赵斌广东医科大学附属医院神经病学研究所广东湛江524001 广东医科大学附属医院神经内科广东湛江524001

目的探讨miRNA-146a靶向干预对晚期APP/PS1(APPswe/PSEN1dE9)双转基因小鼠认知功能的改善作用。方法选用18月龄APP/PS1小鼠,分为AD组、干预组(ADI组)、同月龄C57小鼠(CON组),每组6只。ADI组小鼠给予miRNA-146a agomir 1 nmol,隔日鼻腔给药,AD组和CON组小鼠用DEPC(diethyl pyrocarbonate)代替,30 d后,采用Morris水迷宫、Y迷宫进行行为认知功能检测,免疫荧光和ELISA检测海马内Aβ含量的变化,同时采用Western Blotting检测海马内tau蛋白异常磷酸化的变化。结果ADI组小鼠的逃避潜伏期随着训练次数逐渐下降,与同龄AD组小鼠相比,第2、3、4、5天的逃避潜伏期明显缩短,在原平台所在象限停留时间及游泳路程百分比均明显增加(Pagomir靶向干预可改善晚期AD小鼠的行为和认知功能障碍,降低AD小鼠海马区Aβ/Aβ42蛋白的沉积及tau蛋白的异常磷酸化水平,缓解AD病理、生理进程。

关键词： miRNA-146a agomir 阿尔茨海默病 Morris水迷宫 Aβ tau

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