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Klebsiella oxytoca HP1 adhe基因插入失活法构建产氢重组菌

科学通报 2007年第1期52卷 55-58页

作者：朱俊波龙敏南徐方成邬小兵徐惠娟厦门大学化学化工学院化学工程与生物工程系厦门361005 厦门大学生命科学学院厦门大学生物能源中心厦门361005

乙醇是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)HP1厌氧发酵产H2的主要副产物,每生成1.0 mol的乙醇需要消耗2.0 mol NAD(P)H,从而降低了H2的产量.本研究以编码乙醇脱氢酶系(含乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶活性)的adhe基因为改造目标,利用同源重... 详细信息

乙醇是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)HP1厌氧发酵产H2的主要副产物,每生成1.0 mol的乙醇需要消耗2.0 mol NAD(P)H,从而降低了H2的产量.本研究以编码乙醇脱氢酶系(含乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶活性)的adhe基因为改造目标,利用同源重组技术获得了以提高产氢为目标的***重组菌.构建工作包括:根据adhe基因保守序列框克隆*** HP1 adhe基因片段,以质粒pMHE6为模板进行链霉素抗性基因表达盒的扩增,表达链霉素抗性的aadA基因片段和adhe基因片段分别与载体pMD18-T相连构建重组质粒,同源整合质粒pTA-Str的构建,以链霉素作为筛选标记筛选重组菌.菌落PCR鉴定结果表明,aadA基因表达盒通过质粒pTA-Str的介导已定点插入*** HP1基因组中,成功地构建了adhe基因部分片段缺失的重组菌.葡萄糖发酵实验结果表明,相同发酵条件下,重组菌比野生菌的产氢量提高了16.07%,乙醇产量下降了70.47%.利用基因工程技术提高产氢初步获得成功.

关键词： Klebsiella oxytoca HP1 adhe基因发酵产氢基因插入失活

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Klebsiella oxytoca HP1乙醇脱氢酶基因敲除对产氢的影响(英文)

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中山大学学报（自然科学版） 2007年第B6期46卷 327-328页

作者：徐方成洪华生厦门大学环境科学研究中心∥近海海洋环境科学国家重点实验室

Klebsiella oxytoca HP1是从温泉筛选得到的很有潜力的产氢菌株。为了进一步提高产氢能力,应用同源重组技术构建了乙醇途径缺少菌株,并分析和比较了野生菌和工程菌的代谢流量分布。

关键词：代谢工程发酵产氢 Klebsiella oxytoca HP1 adhe基因

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产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）HP1高效产氢工程菌的构建

产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）HP1高效产氢工程菌的构建

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作者：朱俊波厦门大学

学位级别：硕士

产氢细菌的产氢能力不高是限制生物制氢技术发展的重要因素。运用分子生物学的手段对菌种进行改造,是提高生物产氢效率的重要方法。乙醇和乳酸是产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HP1厌氧发酵产H2的主要副产物,切断无益副产物能提高H2... 详细信息

产氢细菌的产氢能力不高是限制生物制氢技术发展的重要因素。运用分子生物学的手段对菌种进行改造,是提高生物产氢效率的重要方法。乙醇和乳酸是产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca HP1厌氧发酵产H2的主要副产物,切断无益副产物能提高H2产量和底物转化率。本研究以K. oxytoca HP1作为受体,构建了同源双臂整合载体pTA-Str和pLDH-Tr。利用内源平台双交换原理,将质粒pMHE6上携带的氨基葡萄糖苷腺苷转移酶基因(Aminoglycoside-3’-adenyltransferase,aadA)外源表达盒序列(含T7启动子,aadA编码框,T4终止子)定点插入到受体菌细胞染色体乙醇脱氢酶系(含乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶活性)基因adhe +868～+869区(adhe起始编码框为+1)位点上。并在此基础上以质粒pTA-Str介导K. oxytoca HP1 adhe的插入失活,获得了具有链霉素抗性的adhe-突变株。运用类似方法将pBR322上携带的四环素抗性蛋白基因(tetracycline resistance protein,tet)外源表达盒序列(含P1、P2启动子,tet编码框)定点插入到受体菌细胞染色体乳酸脱氢酶基因LDHa +518～+519区( LDHa起始编码框为+1)位点上。在此基础上以质粒pLDH-Tr介导K. oxytoca HP1 LDHa的插入失活,获得了具有四环素抗性的LDHa-突变株。葡萄糖发酵实验结果表明,相同发酵条件下, adhe-突变菌比野生菌的产氢量提高了16.07%,乙醇产量下降了70.47%;LDHa-突变株比野生菌的产氢量提高了20.35%。本研究构建的Klebsiella oxytoca HP1突变株adhe-和LDHa-,将为进一步研究高效产氢系统奠定基础。

关键词： Klebsiella oxytoca HP1 adhe基因 LDHa基因生物制氢基因插入失活

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利用乳清高产2,3-丁二醇的发酵优化及菌株改造

利用乳清高产2,3-丁二醇的发酵优化及菌株改造

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作者：王亚洲天津科技大学

学位级别：硕士

2,3-丁二醇是一种重要的化工原料,广泛用于化工、食品、燃料以及航空航天等多个领域。乳清是一种廉价且易得的有机碳源,以其为原料用生物法生产2,3-丁二醇是未来具竞争力的2,3-丁二醇生产方法。而在已经报道的利用乳清(粉)生产2,3-丁二... 详细信息

2,3-丁二醇是一种重要的化工原料,广泛用于化工、食品、燃料以及航空航天等多个领域。乳清是一种廉价且易得的有机碳源,以其为原料用生物法生产2,3-丁二醇是未来具竞争力的2,3-丁二醇生产方法。而在已经报道的利用乳清(粉)生产2,3-丁二醇的研究中,2,3-丁二醇的终浓度和生产强度较低。本实验优化乳清粉生产2,3-丁二醇的相关工艺,旨在能够高效利用乳清粉生产2,3-丁二醇,为利用乳清粉生产2,3-丁二醇的产业化提供参考。细菌发酵生产2,3-丁二醇的过程中伴随着其他副产物的生成,副产物的存在降低了 2,3-丁二醇的转化率。本论文利用代谢工程方法阻断相关副产物代谢途径,以提高菌株的2,3-丁二醇生成能力。(1)比较5株菌利用乳糖产2,3-丁二醇的发酵情况,发现肺炎克雷伯氏菌CICC 10781和产酸克雷伯氏菌CICC 21518在利用乳清产2,3-丁二醇方面有较大潜力。通过进一步比较两株菌利用乳糖、葡萄糖、半乳糖、混合糖和乳清的能力,同时考虑到菌株生物安全性,最终确定菌株CICC 21518为最适菌株。(2)通过摇瓶实验,优化菌株CICC21518利用乳清粉发酵产2,3-丁二醇的发酵条件。最适发酵条件为:初始pH6.5,转速180r/min,温度32℃,装液量125mL,接种量7%。在此基础上,通过单因素和响应面实验设计对培养基成分进行优化,最适培养基为:预处理乳清粉110g/L,尿素0.54g/L,柠檬酸钠3.65g/L,乙酸钠5.45 g/L,磷酸氢二钾 5 g/L,Mn2+ 0.025 g/L,Mg2+ 0.05 g/L,Zn2+0.005 g/LFe2+ 0.005 g/L。(3)在发酵罐水平,初步建立了乳清发酵在线控制策略。pH分两段控制,0-8h,pH维持在6.5,8h至发酵结束pH维持在6;搅拌转速维持在500r/min;并以分批补料发酵提高2,3-丁二醇产量。发酵在60h结束,2,3-丁二醇浓度为57.63 g/L,转化率为0.397g/g,生产强度0.961 g/(L·h),与国内外已报道的研究结果相比较,2,3-丁二醇的产量和生产强度有较大提高。(4)为了抑制副产物乙醇的生成,提高2,3-丁二醇产量,本实验敲除了乙醇代谢相关的adhe基因。重组菌株的乙醇浓度较野生型菌株降低了 93%,2,3-丁二醇浓度提高了 8.3%。

关键词：乳清 2,3-丁二醇产酸克雷伯氏菌工艺优化 adhe基因

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Enhanced hydrogen production by insertional inactivation of adhe gene in Klebsiella oxytoca HP1

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Chinese Science Bulletin 2007年第4期52卷 492-496页

作者： ZHU JunBo LONG MinNan XU Fangcheng WU XiaoBing XU HuiJuan Department of Chemical and Biochemical Engineering College of Chemistry and Chemical Engineering Xiamen University Xiamen 361005 China Bio-Energy Center School of Life Science Xiamen University Xiamen 361005 China

Ethanol is the main byproduct of anaerobic H2-producing fermentation in Klebsiella oxytoca HP1. Two moles of NAD(P)H are consumed to yield one mole of ethanol that may decrease bacterial hydrogen production. In this article the adhe gene that codes for acetaldehyde dehydrogenase was disrupted for the first time. A homologous recombination vector pTA-Str was constructed in which the adhe gene was disrupted by inserting an aminoglycoside-3'-adenyltransferase (aadA) gene. As expected, the vector includes the insertion 5′-adhe-aadA-adhe-3′. The amplified DNA fragment 5′-adhe-aadA-adhe-3′ from pTA-Str was transformed into K. oxytoca HP1 and one recombinant was obtained. PCR analysis of the resulting genomic DNA indicated the appropriate deletion and insertion. Compared with the H2-production of wild type K. oxytoca HP1, the hydrogen yield of the mutant increased by 16.07% and ethanol concentration decreased by 77.47%, suggesting that inactivation of the adhe gene in K. oxy- toca HP1 is a potential method for enhancing bacterial H2-production.

关键词：产酸克雷伯氏菌厌氧发酵氢气产量 adhe基因插入失活同源重组

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