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SCFβ-TRCP E3 ubiquitin ligase targets the tumor suppressor znrf3 for ubiquitination and degradation

Protein & Cell 2018年第10期9卷 879-889页

作者： Yanpeng Ci Xiaoning Li Maorong Chen Jiateng Zhong Brian J. North Hiroyuki Inuzuka Xi He Yu Li Jianping Guo Xiangpeng Dai School of Life Science and Technology Harbin Institute of Technology Harbin 150001 China Department of Pathology Beth Israel Deaconess Medical Center Harvard Medical School Boston MA 02215 USA Department of Biochemistry and Molecular Biology Shanxi Medical University Taiyuan 030001 China The FM Kirby Neurobiology Center Children's Hospital Boston Harvard Medical School Boston MA 02115 USA Department of Oncology The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University Xinxiang 453100 China Center for Advanced Stem Cell and Regenerative Research Tohoku University Graduate School of DentistrySendai 980-8575 Japan

Wnt signaling has emerged as a major regulator of tissue development by governing the self-renewal and maintenance of stem cells in most tissue types. As a key upstream regulator of the Wnt pathway, the transmem- brane E3 ligase znrf3 has recently been established to play a role in negative regulation of Wnt signaling by targeting Frizzled （FZD） receptor for ubiquitination and degradation. However, the upstream regulation of znrf3, in particular the turnover of znrf3, is still unclear. Here we report that znrf3 is accumulated in the presence of proteasome inhibitor treatment independent of its E3-ubiquitin ligase activity. Furthermore, the Cullin f-specific SCF complex containing β-TRCP has been identified to directly interact with and ubiqui- tinate znrf3 thereby regulating its protein stability. Similar with the degradation of β-catenin by β-TRCP, znrf3 is ubiquitinated by β-TRCP in both CKI-phos- phorylation- and degron-dependent manners. Thus, our findings not only identify a novel substrate for β-TRCP oncogenic regulation, but also highlight the dual regu- lation of Wnt signaling by β-TRCP in a context-dependent manner where β-TRCP negatively regulates Wnt signaling by targeting β-catenin, and positively regulates Wnt signaling by targeting znrf3.

关键词： znrf3 β-TRCP Wnt ubiquitination CKI

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znrf3通过Hedgehog信号通路促进肝癌细胞凋亡的初步研究

ZNRF3通过Hedgehog信号通路促进肝癌细胞凋亡的初步研究

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作者：王珊南华大学

学位级别：硕士

目的:本课题研究znrf3基因在肝及肝癌组织的中表达情况,同时通过过表达技术来研究znrf3对HepG2肝癌细胞凋亡的影响及作用机制;阐明znrf3基因对肝癌的发展进程是否具有调控作用及其调控的机制,也为肝癌的早期发现及预后提供新的标志物。... 详细信息

目的:本课题研究znrf3基因在肝及肝癌组织的中表达情况,同时通过过表达技术来研究znrf3对HepG2肝癌细胞凋亡的影响及作用机制;阐明znrf3基因对肝癌的发展进程是否具有调控作用及其调控的机制,也为肝癌的早期发现及预后提供新的标志物。方法:免疫组化方法检测肝癌组织芯片中肝癌组织（40例）及癌旁组织（30例）中znrf3表达水平;将肝癌细胞HepG2分为三组:I:空白对照组;II:转染空质粒组;III:转染过表达znrf3质粒组。构建znrf3重组质粒,采用瞬时转染脂质体介导的方法将空质粒及过表达质粒分别转染至II、III组HepG2细胞,I组细胞无处理。在荧光显微镜下观察转染空质粒组和转染过表达znrf3质粒组细胞的转染效率,流式凋亡实验检测细胞凋亡率的变化;RT-PCR检测Hedgehog信号通路中关键组件Smo、Gli1的mRNA水平;Western blot检测Hedgehog信号通路中关键组件Smo、Gli1的蛋白水平。结果:znrf3在肝癌组织中表达比肝正常组织中低。瞬时转染结果显示,荧光显微镜下观察可见视野中的HepG2细胞大部分可见绿色荧光,转染率较高（大于80%）。流式细胞仪检测结果显示:与I组及II组相比,III组HepG2细胞凋亡率明显增加（P＜0.05）。而I组及II组相比,凋亡率无明显变化（P≥0.05）。Western-Blot检测Smo、Gli1结果显示,与I组及II组相比,III组的HepG2细胞Smo、Gli1的蛋白的表达水平显著降低（P＜0.05）,而I组与II组相比,差异无统计学意义（P≥0.05）。RT-PCR检测Smo、Gli1结果显示,与I组及II组相比,III组的Hep G2细胞mRNA的水平显著下调（P＜0.05）,而I组及II组相比,差异无统计学意义（P≥0.05）。结论:znrf3在肝癌组织表达低,过表达znrf3抑制Hedgehog/Smo/Gli1信号通路,从而促进肝癌细胞的凋亡。

关键词： znrf3 凋亡 Hedgehog信号通路 Smo Gli1 肝癌

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znrf3及KAT6B在胃腺癌组织中的表达及临床意义

ZnRF3及KAT6B在胃腺癌组织中的表达及临床意义

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作者：吴秋桂南华大学

学位级别：硕士

目的:探索锌指环指蛋白3（zinc and ring finger 3,znrf3）、赖氨酸乙酰基转移酶6B（lysine acetyltransferase 6B,KAT6B）两个可能的hsa-mi R-135b-5p的靶基因在不同胃组织中的表达情况及其与胃腺癌临床病理特征的相关性,分析在胃腺癌... 详细信息

目的:探索锌指环指蛋白3（zinc and ring finger 3,znrf3）、赖氨酸乙酰基转移酶6B（lysine acetyltransferase 6B,KAT6B）两个可能的hsa-mi R-135b-5p的靶基因在不同胃组织中的表达情况及其与胃腺癌临床病理特征的相关性,分析在胃腺癌中znrf3及KAT6B表达的相关性,为胃腺癌的诊断和治疗提供更多可能的线索。方法:采用免疫组织化学法（immunohistochemistry,IHC）分别检测70例胃腺癌患者、31例胃癌旁组织及30例胃癌前病变组织中znrf3和KAT6B的表达情况。收集胃腺癌患者肿瘤大小、脉管侵犯及神经侵犯等临床及病理资料,采用SPSS18.0对数据进行整理及统计学分析。结果:（1）znrf3蛋白定位在细胞质中。znrf3蛋白在胃癌旁组织、胃癌前病变组织、胃腺癌组织中的阳性表达率分别是80.65%（25/31）、70.00%（21/30）、41.43%（29/70）,表达差异具有统计学意义（P=0.001）。znrf3在癌旁组织及癌前病变组织的阳性率高于胃癌组织（P=0.001/P=0.009）,但在癌旁组织与癌前病变组织的表达差异无统计学意义（P=0.334）。znrf3蛋白与胃腺癌组织的临床病理特征分析提示:znrf3蛋白表达水平与胃腺癌TNM分期存在相关性,在I、II期中znrf3的阳性表达率54.05%（20/37）高于胃腺癌III、IV期的阳性表达率27.27%（9/33）（P=0.023）。znrf3蛋白的表达水平与胃腺癌患者的性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、脉管侵犯、神经侵犯病理特征均无统计学意义（P＞0.05）。（2）KAT6B蛋白定位在细胞质中。KAT6B蛋白在胃癌旁组织、胃癌前病变组织、胃腺癌组织中的阳性表达率分别是67.74%（21/31）、60.00%（18/30）、32.86%（23/70）,其表达差异有统计学意义（P=0.002）。KAT6B在胃腺癌的表达量低于癌旁组织及癌前病变组织（P=0.001/P=0.011）,但在癌旁组织与胃癌前病变组织的表达差异无统计学意义（P=0.529）。KAT6B与胃腺癌临床病理特征分析提示,KAT6B蛋白表达水平与患者性别、发病年龄、肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移、分化程度、脉管侵犯、神经侵犯病理特征均无统计学意义（P＞0.05）。（3）采用spearman相关分析发现,在胃腺癌中,znrf3表达量与KAT6B的表达量无相关性（P＞0.05）。结论:（1）znrf3及KAT6B两种蛋白在胃腺癌组织的表达水平低于癌旁组织及癌前病变组织,两种蛋白在胃腺癌组织中的表达无明显相关性;（2）znrf3的表达水平与胃腺癌TNM分期相关,分期越晚znrf3阳性表达率越低。

关键词： znrf3 KAT6B 胃腺癌免疫组化

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miR-184靶向znrf3调控口腔鳞状细胞癌增殖和转移的分子机制

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中国老年学杂志 2021年第5期41卷 1075-1080页

作者：辛欣綦成王昕山东大学第二医院口腔科山东济南250000 济南市口腔医院牙周黏膜病科

目的探讨微小RNA-184(miR-184)对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其作用的分子生物学机制。方法利用qRT-PCR与Western印迹技术分别检测舌鳞癌细胞系及正常口腔黏膜细胞中miR-184、znrf3 mRNA及蛋白表达水平。将anti-m... 详细信息

目的探讨微小RNA-184(miR-184)对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其作用的分子生物学机制。方法利用qRT-PCR与Western印迹技术分别检测舌鳞癌细胞系及正常口腔黏膜细胞中miR-184、znrf3 mRNA及蛋白表达水平。将anti-miR-184、si-znrf3及其阴性对照分别或共同转染入舌鳞癌细胞SCC-9中,采用噻唑蓝(MTT)与Transwell法检测转染后各组细胞增殖、迁移及侵袭能力的改变。双荧光素酶报告基因方法检测miR-184与znrf3的靶向关系。Western印迹法检测细胞增殖、迁移、侵袭及上皮-间质转化(EMT)相关蛋白表达。结果相对于正常口腔黏膜细胞,OSCC细胞系中miR-184表达水平显著上调,而znrf3 mRNA及蛋白表达水平显著下调;双荧光素酶报告基因实验验证znrf3是miR-184的靶基因;SCC-9细胞中转染anti-miR-184能显著抑制miR-184表达水平,降低SCC-9细胞增殖、迁移及侵袭能力,而共转染si-znrf3可逆转anti-miR-184对SCC-9细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用;沉默miR-184后SCC-9细胞中CDK4、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)-3、MMP-9、N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平显著下调,而β-catenin、E-cadherin蛋白表达水平显著上调,而共转染si-znrf3可逆转其作用。结论miR-184可通过抑制znrf3表达调控EMT进程进而促进OSCC细胞增殖、迁移及侵袭。

关键词：口腔鳞状细胞癌 miR-184 znrf3 增殖迁移侵袭

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Hsa-miR-135b-5p靶向抑制znrf3对胃癌细胞SGC-7901增殖和凋亡的影响

Hsa-miR-135b-5p靶向抑制ZNRF3对胃癌细胞SGC-7901增殖和凋亡的影...

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作者：欧阳佳凤南华大学

学位级别：硕士

目的:研究hsa-miR-135b-5p对胃癌细胞增殖和凋亡的影响,并筛选hsa-miR-135b-5p的下游基因,探讨hsa-miR-135b-5p通过调控锌指蛋白3(Zinc and ring finger 3,znrf3)影响胃癌细胞SGC-7901增殖和凋亡的具体机制。方法:1.采用qRT-PCR技术检测胃癌组织、癌旁正常组织、正常胃上皮细胞株GES-1以及胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803中hsa-miR-135b-5p的表达水平。2.生物信息学分析:(1)使用miRNA靶基因在线预测网站Target Scan、miRDB和DIANA-micro T联合预测hsamiR-135b-5p靶向的m RNA;(2)通过GO注释与KEGG富集技术分析hsa-miR-135b-5p下游靶基因的生物学功能以及参与的信号通路。3.构建野生型载体znrf3-wt和突变型载体znrf3-mut,转染293T细胞,采用双荧光素酶报告实验分析znrf3和hsa-miR-135b-5p的靶向关系。4.在胃癌细胞株SGC-7901中分别转染hsa-miR-135b-5p mimic、hsa-miR-135b-5p inhibitor及相应的阴性对照(NC)用于上调或下调hsa-miR-135b-5p的表达,q RT-PCR技术确认hsa-miR-135b-5p上调和下调效果,并检测hsa-miR-135b-5p上调或下调时znrf3m RNA水平的变化。5.在SGC-7901细胞中共转染hsa-miR-135b-5p inhibitor和znrf3 si RNA,分组如下:hsa-miR-135b-5p inhibitor+znrf3 si RNA、hsa-miR-135b-5p inhibitor+si RNA NC、inhibitor NC+znrf3 si RNA、inhibitor NC+si RNA NC,使用CCK8和Annexin VAPC/PI实验分别检测细胞增殖和凋亡,进一步明确hsa-miR-135b-5p通过靶向调控znrf3对胃癌细胞的增殖和凋亡的影响。结果:1.所检测的5对胃癌临床标本中,hsa-miR-135b-5p在胃癌组织中的平均表达量明显高于癌旁组织,差异有统计学意义(p35b-5p在胃癌细胞SGC-7901与MGC-803中均呈现高表达,以SGC-7901细胞中hsa-miR-135b-5p表达水平最高,差异有统计学意义(p35b-5p与znrf3存在靶向结合关系,且有373个靶基因能被Target Scan、miRDB和DIANA-micro T三个在线网站同时预测;GO注释和KEGG富集分析表明hsa-miR-135b-5p的下游靶基因主要参与了细胞凋亡、蛋白磷酸化和RNA转录等生物学过程,并在Wnt、Hippo及c AMP等肿瘤相关信号通路中发挥作用。3.双荧光素酶报告实验显示在293T细胞中过表达hsa-miR-135b-5p可以抑制野生型znrf3报告载体(znrf3-wt)的荧光表达(pznrf3报告载体(znrf3-wt)荧光表达不受影响,表明hsa-miR-135b-5p与znrf3 3’UTR存在靶向结合关系。4.q RTPCR显示hsa-miR-135b-5p上调能抑制SGC-7901中znrf3 m RNA的水平,而hsa-miR-135b-5p下调能使znrf3的表达量增加,差异有统计学意义(p35b-5p下调可以抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖,而znrf3低表达能削弱hsamiR-135b-5p下调产生的SGC-7901增殖抑制作用(p35b-5p下调能增加SGC-7901细胞的凋亡率,而znrf3受抑能“挽救”hsa-miR-135b-5p下调引起的SGC-7901凋亡增加(p35b-5p在胃癌组织和细胞系中高表达;***3是hsa-miR-135b-5p的下游靶基因;***-miR-135b-5p通过靶向抑制抑癌基因znrf3的表达,能促进胃癌细胞SGC-7901的增殖,并抑制其凋亡。

关键词：胃癌 hsa-miR-135b-5p znrf3 增殖凋亡

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肝脏znrf3/RNF43调节机体能量代谢的作用与机制研究

肝脏ZNRF3/RNF43调节机体能量代谢的作用与机制研究

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作者：袁依妮上海交通大学

学位级别：硕士

肝脏是参与体内物质代谢的关键器官,是机体进行糖脂代谢,维持营养平衡的主要器官。肝脏是分泌器官可分泌肝因子,经旁分泌或内分泌途径,调控其他组织代谢,进而影响全身能量代谢。环指蛋白znrf3和RNF43属于单次跨膜E3泛素连接酶家族,均由... 详细信息

肝脏是参与体内物质代谢的关键器官,是机体进行糖脂代谢,维持营养平衡的主要器官。肝脏是分泌器官可分泌肝因子,经旁分泌或内分泌途径,调控其他组织代谢,进而影响全身能量代谢。环指蛋白znrf3和RNF43属于单次跨膜E3泛素连接酶家族,均由一个信号肽、细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内环状结构域组成,环状结构域为其功能域,可使Wnt信号通路受体翻转而泛素化降解,进而负调控Wnt信号通路。Wnt信号通路与能量代谢密切相关。因znrf3与RNF43结构上高度同源,功能上也相似,二者对Wnt信号通路的作用类似,存在交互作用,对单一基因分别敲除时可能出现功能补偿,因此将二者放在一起研究。本研究旨在阐明znrf3/RNF43对糖和脂代谢以及对机体能量代谢的调控作用。本研究采用Cre-loxP重组酶系统对小鼠进行肝脏特异性znrf3/RNF43双敲除,监测小鼠体重、体温、代谢率等代谢参数,发现肝脏znrf3/RNF43双敲除可减轻肥胖小鼠体重,升高小鼠体温,增加基础代谢率;通过葡萄糖耐量试验及肝脏甘油三酯的测定,监测肝脏糖脂代谢水平变化,并检测血清胰岛素,发现znrf3/RNF43双敲除可改善肝脏胰岛素抵抗,抑制糖异生,减轻肝脏脂质沉积,减轻炎症状态;同时检测脂肪组织含量及相关分子生物学分析,发现znrf3/RNF43双敲除小鼠可减少脂质合成,减轻脂肪组织炎症,促进白色脂肪棕色化改变;进一步采用代谢组学和基因组序列分析,提示znrf3/RNF43可影响代谢物质变化及相关肝因子表达。综上本研究发现肝脏特异性znrf3/RNF43双敲除可通过调节代谢产物、肝因子等改善全身胰岛素抵抗,减少脂质合成,促进棕色化以增加能量消耗,为肥胖和2型糖尿病治疗提供新的线索。另一方面,肥胖导致脂质代谢紊乱,影响脂质分布,出现异位脂质沉积。本研究主要探索小檗碱对骨骼肌异位脂质沉积和骨骼肌细胞线粒体功能的影响,通过对db/db肥胖小鼠和C2C12细胞进行小檗碱干预处理,观察小檗碱对骨骼肌能量代谢的影响。实验结果显示小檗碱可降低骨骼肌甘油三酯含量,增加骨骼肌细胞线粒体数量,增强线粒体功能。通过分子生物学分析,实验结果表明小檗碱可通过AMPK途径促进PGC1a转录因子的表达。同时,实验结果显示小檗碱可增加C2C12细胞最大耗氧率,表明小檗碱能增强线粒体氧化功能。本研究结果证明小檗碱可减少骨骼肌中异位脂质沉积,增强线粒体功能,提高机体基础代谢率。

关键词： znrf3 RNF43 肝脏能量代谢脂质沉积

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肿瘤抑制因子znrf3在胃腺癌发病中的作用机制研究

肿瘤抑制因子ZNRF3在胃腺癌发病中的作用机制研究

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作者：周晔辉苏州大学

学位级别：硕士

目的：本课题研究znrf3在胃腺癌组织中及胃癌旁组织的的表达差异，阐明其与临床病理相关指标以及预后的关联;同时通过过表达技术来研究znrf3在SGC-7901胃癌细胞株中的增殖、凋亡的作用机制;阐明znrf3在胃腺癌发生发展中的作用机制，为... 详细信息

目的：本课题研究znrf3在胃腺癌组织中及胃癌旁组织的的表达差异，阐明其与临床病理相关指标以及预后的关联;同时通过过表达技术来研究znrf3在SGC-7901胃癌细胞株中的增殖、凋亡的作用机制;阐明znrf3在胃腺癌发生发展中的作用机制，为临床病理提供新的参考指标，也为肿瘤的靶向治疗提供了新的位点。方法：收集胃癌切除术后的肿瘤标本83例，免疫组化及Western blot方法检测胃腺癌肿瘤标本及癌旁组织中的znrf3和Ki-67的表达水平;构建pEGFP-znrf3重组质粒，SGC-7901过表达znrf3后;应用CCK-8的方法，检测znrf3对胃癌细胞株增殖的影响;Anexin V/PI双标过表达znrf3的SGC-7901细胞，流式细胞仪检测znrf3对凋亡的影响;过表达znrf3，Western blot检测Wnt通路中关键组件beta-catenin以及TCF-4的变化情况。结果：胃腺癌组织中的znrf3表达水平低于癌旁组织，胃腺癌的分化程度以及淋巴结转移与znrf3的表达水平相关，过表达znrf3可以抑制SGC-7901的增殖，促进其凋亡;znrf3通过Wnt/beta-catenin/TCF信号通路发挥作用。结论：znrf3在胃腺癌组织中通过Wnt/beta-catenin/TCF通路发挥肿瘤抑制因子的作用。

关键词： znrf3 E3泛素连接酶胃腺癌 Wnt信号通路肿瘤抑制因子

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