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转录因子znf24在结直肠癌发生发展中的作用研究

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转录因子ZNF24在结直肠癌发生发展中的作用研究

作者：田硕中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

研究背景:结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,在中国的发病率逐年升高,且患者生存率较低,其中,肿瘤的复发转移是导致结直肠癌死亡率较高的重要影响因素。结直肠癌的发病机制十分复杂,涉及多种癌基因、抑癌基... 详细信息

研究背景:结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,在中国的发病率逐年升高,且患者生存率较低,其中,肿瘤的复发转移是导致结直肠癌死亡率较高的重要影响因素。结直肠癌的发病机制十分复杂,涉及多种癌基因、抑癌基因的异常表达。因此,致力于研究结直肠癌发生发展的机制,特别是结直肠癌复发转移的机制显得尤为重要。研究表明,多种转录因子在结直肠癌等肿瘤中异常表达,在肿瘤的发生发展、侵袭和转移中起着重要的作用,正受到越来越多的关注,如在肿瘤微环境参与血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)表达调控的转录因子 3(Signal Transducer And Activator Of Transcription 3,STAT3)已成为新的抗肿瘤药物的作用靶点。转录因子znf24(又称KOX17或znf191)是类Krüppel锌指家族的一员,其基因定位于染色体18q12.1,在人类多种肿瘤中常发现该区域的缺失,如浸润性乳腺癌,结直肠癌等。目前研究报道了 znf24在前列腺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌和甲状腺癌中的表达情况及作用机制,但znf24在结直肠癌中的作用尚未有报道。因此,研究znf24在结直肠癌发生发展中的作用具有重要的意义。研究目的:阐明znf24在结直肠癌发生发展中的作用,初步探讨znf24在结直肠癌发病(尤其复发转移)中的作用机制,为寻找结直肠癌的诊断标志物或治疗靶点提供线索。方法和结果:1、利用在线工具UALCAN分析癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库,探究znf24在结直肠癌中的表达情况,结果显示znf24在结直肠癌中表达下调;进一步分析结直肠癌的不同类型,发现相比正常组织,znf24在结直肠腺癌中表达下调,而在结直肠粘液腺癌中差异表达不具有统计学意义。2、利用实时荧光定量PCR和免疫蛋白印记(Western-Blot)检测znf24在15例(腺癌13例、粘液腺癌2例)临床结直肠癌组织中的表达情况,结果显示相比癌旁组织,13例腺癌组织中有11例znf24表达水平下调,而粘液腺癌组织中znf24表达水平未见显著差异。进一步统计15例临床样本中znf24的表达水平,结果显示与癌旁组织相比,znf24在结直肠癌中的表达显著下调。3、利用实时荧光定量PCR和Western-Blot检测znf24在结直肠癌HCT116和SW620细胞中的表达情况,结果显示相比正常肠上皮NCM460细胞,znf24在结直肠癌细胞中表达下调。4、通过CCK-8细胞增殖、细胞平板克隆形成、细胞周期流式分析、细胞划痕、Transwell迁移及侵袭实验,检测znf24过表达与干扰对结直肠癌HCT116和SW620细胞的影响,结果表明过表达znf24能抑制结直肠癌细胞增殖与克隆形成,阻滞细胞周期于G0-G1期,抑制细胞迁移与侵袭;而干扰下调znf24能促进结直肠癌细胞增殖与克隆形成,促进细胞周期进程,促进细胞迁移与侵袭。5、通过裸鼠皮下成瘤和脾-肝转移实验检测体内znf24过表达与干扰对结直肠癌HCT116细胞增殖和转移的影响,结果表明体内过表达znf24能抑制结直肠癌细胞的增殖和转移;而干扰下调znf24能促进结直肠癌细胞的增殖和转移。6、结合文献与先前工作,我们筛选并推测基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinase 2,MMP2)可能是znf24调控的靶基因。通过分析结直肠癌HCT116和SW620细胞中znf24过表达与干扰对MMP2表达的影响,以及分析临床结直肠癌的组织样本,发现znf24与MMP2表达水平负相关性。7、通过构建系列荧光素酶报告基因载体,查找已知的znf24结合靶序列并定点突变,进行双荧光素酶报告基因实验结果提示znf24可能通过与MMP2启动子上游序列(-1898/-1906,TTTCCATTT)结合,转录抑制MMP2的表达。结论:znf24在结直肠癌中表达下调;znf24抑制结直肠癌细胞增殖、克隆形成、侵袭和转移,阻滞细胞周期进程,是抑癌基因;在结直肠癌中,znf24与MMP2表达负相关,znf24可能通过与MMP2启动子上游序列(-1898/-1906,TTTCCATTT)结合,转录抑制MMP2的表达。

关键词： znf24 结直肠癌抑癌基因基质金属蛋白酶2(MMP2)

znf24基因过表达慢病毒载体的构建及其在人结直肠癌HCT116细胞中的表达

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药学实践与服务 2023年第4期41卷 222-226页

作者：田硕厉建中海军军医大学药学系生化药学教研室上海200433

目的通过构建znf24基因过表达慢病毒载体,建立znf24基因过表达的人结直肠癌HCT116细胞株,为开展后续研究提供物质基础。方法通过PCR扩增znf24基因序列片段和3FLAG标签序列片段,并将两产物通过同源重组克隆至慢病毒载体pMT406中,构建成... 详细信息

目的通过构建znf24基因过表达慢病毒载体,建立znf24基因过表达的人结直肠癌HCT116细胞株,为开展后续研究提供物质基础。方法通过PCR扩增znf24基因序列片段和3FLAG标签序列片段,并将两产物通过同源重组克隆至慢病毒载体pMT406中,构建成重组表达znf24慢病毒质粒pMT-znf24。将重组质粒pMT-znf24与辅助包装载体质粒pCMV-dR8.9和pCMV-VSV-G一起共转染293T细胞并收集慢病毒。应用孔稀释法检测病毒滴度,用qRT-PCR和蛋白印迹法检测慢病毒转染HCT116细胞后znf24的表达水平。结果成功构建了重组载体pMT-znf24,并获得相应的病毒,病毒滴度为3.25×10^(9) TU/ml。转染重组znf24慢病毒的HCT116细胞中znf24表达水平显著高于空白组和阴性对照组细胞。结论构建了znf24基因过表达慢病毒载体,并获得相应的病毒和稳定表达znf24的HCT116细胞株。

关键词： znf24 结直肠癌慢病毒载体

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转录因子znf24在肿瘤中的研究进展

药学实践与服务 2023年第12期41卷 710-713,721页

作者：田硕厉建中海军军医大学药学系生化教研室上海200433

转录因子znf24(也称znf191或KOX17)是类Krüppel锌指转录因子家族成员,N端有富含亮氨酸(Leu)的SCAN结构域(又称LeR结构域),C端有4个连续的典型的类Krüppel样锌指模体。znf24参与激酶转录活性调控、血管增生、发育等,尤其在肿瘤发生或... 详细信息

转录因子znf24(也称znf191或KOX17)是类Krüppel锌指转录因子家族成员,N端有富含亮氨酸(Leu)的SCAN结构域(又称LeR结构域),C端有4个连续的典型的类Krüppel样锌指模体。znf24参与激酶转录活性调控、血管增生、发育等,尤其在肿瘤发生或发展中起着重要的作用,是多功能的转录因子。znf24通过调控不同靶基因(如VEGF、Wnt8B、Twist1、β-catenin和DGL1等)的转录表达以及竞争性结合蛋白因子(如β-catenin),在肿瘤的发生、发展、侵袭和转移中起着重要复杂的两面性作用(促进和抑制)。因此阐明znf24在肿瘤中的作用机理,将为肿瘤的治疗提供线索与思路。本文将对znf24在肿瘤中的研究进展作一综述。

关键词： znf24 肿瘤转录因子

GST-pulldown验证转录因子znf24与c-Myc的相互作用

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生物技术通讯 2014年第6期25卷 765-769页

作者：赵靖凯王聪张籍鹏厉建中第二军医大学学员旅上海200433 第二军医大学药学院生化药学教研室上海200433

目的:前期酵母双杂交实验中,我们以转录因子znf24的SCAN结构域为诱饵,筛选到的一个阳性克隆为原癌基因c-Myc,在此进一步验证znf24与c-Myc间的相互作用。方法:将znf24与c-Myc分别构建到p GEX-4T-2和pc DNA3.1表达载体上,利用GST-pulldow... 详细信息

目的:前期酵母双杂交实验中,我们以转录因子znf24的SCAN结构域为诱饵,筛选到的一个阳性克隆为原癌基因c-Myc,在此进一步验证znf24与c-Myc间的相互作用。方法:将znf24与c-Myc分别构建到p GEX-4T-2和pc DNA3.1表达载体上,利用GST-pulldown技术体外验证两者表达蛋白的相互作用。结果:电泳鉴定与测序分析表明目的基因克隆正确,载体构建成功;用GST-pulldown技术检测到znf24与c-Myc相互作用的蛋白条带。结论:GST-pulldown实验进一步表明znf24与c-Myc的相互作用,为验证znf24与c-Myc之间存在相互作用奠定了基础。

关键词： znf24 c—Myc GST—pulldown