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锌铁调控蛋白1对兔骨髓间充质干细胞成骨分化作用的研究

锌铁调控蛋白1对兔骨髓间充质干细胞成骨分化作用的研究

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作者：廖小林广西中医药大学

学位级别：硕士

目的:本实验以兔骨髓间充质干细胞(rabbit bone marrow mesenchymal stem cells rabBMSCs)为研究对象。通过锌铁调控蛋白1(zip1)体外作用于rabBMSCs,研究zip1蛋白体外诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的可能机制,为临床治疗酒精性... 详细信息

目的:本实验以兔骨髓间充质干细胞(rabbit bone marrow mesenchymal stem cells rabBMSCs)为研究对象。通过锌铁调控蛋白1(zip1)体外作用于rabBMSCs,研究zip1蛋白体外诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的可能机制,为临床治疗酒精性股骨头坏死提供相关体外研究支持。方法:(1)建立rabBMSCs培养体系,采用不同浓度的酒精(0.00mol/L、0.03 mol/L、0.09 mol/L、0.15 mol/L、0.21 mol/L)处理rabBMSCs6小时,使用Western-Blotting法检测细胞中ALP、OCN、I型胶原以及Runx2蛋白表达情况。(2)构建zip1蛋白过表达载体。以全基因合成法合成zip1基因的全长序列后采用双酶切法进行酶切,目的片段经双酶切后连接入pcDNA3.1(+)载体中,载体构建完成后使用PCR产物电泳及基因测序鉴定,鉴定合格则可用作下一步实验。(3)筛选zip1小干扰RNA(siRNA)。以兔的zip1基因为靶标,经筛选后由生物公司直接合成3对有效zip1 siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3),将3对siRNA分别以25nM浓度转染入rabBMSCs中,同时设正常组即空白对照组培养,36小时后使用R-T PCR对zip1mRNA的表达进行定性分析,筛选出抑制率最高效的zip1 siRNA序列,构建zip1 siRNA载体用于后续进一步实验。(4)zip1参与rabBMSCs成骨分化。将实验分为3个组,A组为正常细胞培养组,B组为zip1过表达组,C组为zip1 siRNA组;细胞培养至48h后采用Western-Blotting检测成骨分化相关蛋白ALP、OCN、I型胶原表达情况。(5)研究zip1蛋白对rabBMSCs凋亡的影响。将实验分为4组,第1组为正常细胞培养组,第2组为缺氧缺糖细胞培养组,第3组为zip1过表达缺氧缺糖培养组,第4组为zip1 siRNA缺氧缺糖培养组。细胞培养2小时后采用tunel法及流式细胞仪检测细胞凋亡率,wb检测凋亡相关蛋白bax及caspase6表达。结果:(1)western-blotting检测细胞中alp蛋白相对含量分别为:0.66±0.03、0.58±0.06、0.51±0.02、0.4±0.02、0.38±0.01;i型胶原蛋白相对含量分别为:0.69±0.03、0.54±0.03、0.59±0.05、0.41±0.02、0.23±0.01;ocn蛋白相对含量分别为:1.08±0.03、1.0±0.05、0.93±0.02、0.68±0.03、0.63±0.01;runx2蛋白相对含量分别为:1.08±0.03、0.65±0.01、0.52±0.02、0.41±0.03、0.35±0.02。(2)zip1过表达载体构建后以通用引物进行测序鉴定,测序峰图正常,无杂峰或叠带,序列对比吻合;(3)釆用real-timepcr技术检测细胞内zip1mrna的结果相对含量分别为:1.00±0.32、0.41±0.18、1.96±0.08、0.11±0.07。(4)经westernblot检测细胞内相关蛋白的表达,alp蛋白相对含量分别为:1.32±0.04、2.67±0.19、0.8133±0.10;i型胶原蛋白相对含量分别为:1.72±0.09、2.68±0.17、1.54±0.17;ocn蛋白相对含量分别为:1.45±0.15、2.08±0.11、0.87±0.06。(5)tunel法检测4组细胞凋亡率分别为(0.66±0.18)%、(13.19±1.8)%、(1.76±0.57)%、(24.43±6)%;(6)流式细胞仪检测4组细胞凋亡率分别为(0.56±0.02)%、(1.29±0.05)%、(0.77±0.04)%、(2.53±0.02)%。(7)western-blotting检测4组细胞中bax蛋白相对表达量分别为0.36±0.02、0.68±0.04、0.68±0.04、1.14±0.3;caspase6蛋白相对表达量分别为0.30±0.05、0.63±0.02、0.38±0.02、0.95±0.03。结论:酒精可以抑制rabbmscs中alp、ocn、rnux2、i型胶原蛋白表达,且随着浓度的增加,抑制效果更显著。alp、ocn、i型胶原、runx2蛋白可作为rabbmscs向成骨分化鉴定指标之一。zip1蛋白可以显著增加rabbmscs成骨分化指标alp、ocn、i型胶原蛋白表达,对rabbmscs向成骨细胞分化具有促进作用。zip1蛋白可显著抑制rabbmscs凋亡。综上结果表明,酒精性股骨头缺血性坏死时股骨头骨髓内成骨减少,可能与酒精诱导骨髓间充质干细胞成骨

关键词： zip1蛋白兔骨髓间充质干细胞成骨分化股骨头缺血性坏死

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