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Target inhibition of caspase-8 alleviates brain damage after subarachnoid hemorrhage

Neural Regeneration Research 2020年第7期15卷 1283-1289页

作者： Da-Qiang Ke zhi-Yang Chen zhou-Ling Li Xia Huang Hui Liang Department of Neurology First Affiliated Hospital School of Medicine Zhejiang University

Caspase-8 plays an important role in the mediation of inflammation and the effect of its role in subarachnoid hemorrhage remains *** nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 inflammasome has been postulated to mediate inflammation during *** aim of the present study was to investigate the effects of caspase-8 inhibition on SAH injury and further elucidate the molecular *** this study,a subarachnoid hemorrhage model was established by endovascular perforation process in adult male Sprague-Dawley rats.z-ietd-fmk(0.5,1,2 mg/kg;an inhibitor of caspase-8)was delivered via intravenous(tail vein)injection immediately after subarachnoid *** 12 hours of subarachnoid hemorrhage,western blot assay showed that the expression of cleaved caspase-8 was significantly increased at 12 hours,peaked at 24 hours,and then decreased at 72 hours after subarachnoid *** staining demonstrated that caspase-8 was expressed in microglia after subarachnoid hemorrhage.z-ietdfmk significantly improved neurological deficits and reduced brain water content 24 hours after subarachnoid *** Morris water maze and rotarod test confirmed that z-ietd-fmk significantly improved spatial learning and memory abilities and motor coordination at 21–27 days after subarachnoid ***,inhibition of caspase-8 activation reduced the expression of pyrin domain-containing 3,caspase-1,and interleukin-1βafter subarachnoid *** conclusion,our findings suggest that caspase-8 inhibition alleviates subarachnoid hemorrhage-induced brain injuries by suppressing *** study was approved by the Institutional Animal Ethics Committee of the First Affiliated Hospital,School of Medicine,zhejiang University,China(approval No.2016-193)on February 25,2016.

关键词： brain water content caspase-8 inflammation Morris water maze neurological function neuroprotection pyrin domain-containing 3 rotarod test subarachnoid hemorrhage z-ietd-fmk

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大鼠脑缺血再灌注后Cathepsin B介导的细胞凋亡与Caspase-8-Caspase-3凋亡信号通路的关系

大鼠脑缺血再灌注后Cathepsin B介导的细胞凋亡与Caspase-8-Caspa...

引用

作者：曾碧园南华大学

学位级别：硕士

目的建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型,通过TTC染色观察不同实验组动物模型脑梗死体积变化,TUNEL检测各实验组不同时间点凋亡细胞数,Western Blot检测Cathepsin B、Caspase-8、Caspase-3在不同时间点蛋白的表达水平,通过分析其各... 详细信息

目的建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型,通过TTC染色观察不同实验组动物模型脑梗死体积变化,TUNEL检测各实验组不同时间点凋亡细胞数,Western Blot检测Cathepsin B、Caspase-8、Caspase-3在不同时间点蛋白的表达水平,通过分析其各种蛋白表达水平的变化规律,判断Cathepsin B与Caspase-8-Caspase-3信号通路之间的关系。使用Cathepsin B、caspase-8特异性抑制剂进行干预,从而推断Cathepsin B与Caspase-8-Caspase-3信号通路之间可能存在的关系。通过电镜酶组织细胞化学法观察各信号通路关键蛋白的特异性抑制剂干预前后的各个时相溶酶体超微结构变化,进一步从微观方面探讨Cathepsin B与Caspase-8-Caspase-3信号通路和溶酶体之间相互关系。探讨Cathepsin B介导的细胞凋亡与Caspase-8-Caspase-3凋亡信号通路在神经细胞凋亡中的相互关系。方法本实验选用健康清洁级雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠制备MCAO模型,共成功造模262只,鼠龄102周左右,体重约24080g。采用完全随机设计,随机将大鼠分为四大组:将大鼠分为脑缺血再灌注组(简称模型组,IRI组82只)及假手术组(16只),抑制剂CA-074Me组(简称CBI组82只),抑制剂z-ietd-fmk(简称C8I组82只),以上四组大鼠按再灌注后0min、15min、30min、2h、6h、12h及24h再分成7个亚组(除24h时间点为16只大鼠外,其余每个时间点亚组为11只)。假手术对照组除了插线较短,不阻塞右侧大脑中动脉外,其他手术流程与其他三组一样。本实验使用改良Longa线栓法制备右侧大脑中动脉局灶性梗死模型(MCAO),选择在大鼠脑缺血2h后拔除线栓,形成再灌注模型。CBI组(cathepsin B抑制剂组)与C8I组(caspase-8抑制剂组)分别采用侧脑室穿刺法注射Cathepsin B特异性抑制剂CA-074Me及Caspase-8蛋白抑制剂z-ietd-fmk(将CA-074Me 10μg溶于5μlDMSO中,于制作MCAO模型前60min注射入大鼠右侧侧脑室中,防止溶液漏出需留针10min;z-ietd-fmk:0.5μg溶于5μlDMSO中,于制备MCAO模型前30min注射入大鼠右侧侧脑室中,同样留针10min,为避免DMSO溶液及侧脑室穿刺损伤造成实验误差,假手术组与模型组需要在相同时间点与相同部位注射相等剂量的DMSO溶液。本实验于再灌注后0min、15min、30min、2h、6h、12h及24h处死动物,以Longa’s的5级标准评分法评价大鼠不同时间点的神经功能缺损;sham组、IRI组、CBI组、C8I组均需取5只缺血再灌注后24h大鼠行TTC检测,观察大鼠脑缺血梗死体积的大小;TUNEL法检测不同组别在7个时间点神经细胞凋亡数目;Western Blot法测Cathepsin B、Caspase-8和Caspase-3在不同时间点蛋白的表达水平,通过分析其各种蛋白表达水平的变化规律,判断Cathepsin B与各信号通路之间的关系;通过电镜酶组织细胞化学法观察各信号通路关键蛋白的特异性抑制剂干预前后的各个时相溶酶体超微结构变化,进一步从微观方面探讨各信号通路和溶酶体之间相互关系。结果***模型造模成功率为90.03%。***染色检测大鼠大脑缺血再灌注24h后的梗死灶时发现,模型组、CBI组、C8I组的24h相对梗死体积分别为37.54±0.86%、23.10±1.01%、29.8±0.94%。Sham组未见明显白色梗死灶,IRI组、CBI组、C8I组的白色缺血梗死灶均比Sham组明显增多,同时CBI组和C8I组的梗死灶体积较IRI组要明显减少(P<0.05),差异具统计学意义。MCAO模型神经功能缺损评分结果与大鼠脑梗死体积一致,IRI组、CBI组、C8I组均出现神经功能缺损症状,但CBI组、C8I组大鼠较IRI组的神经功能缺损症状与体征均有明显改善,差异具统计学意义(P<0.05)。3.使用TUNEL检测脑缺血再灌注损伤后大脑皮质区神经细胞凋亡数目,在Sham组中仅见极少数凋亡细胞,IRI组较Sham组凋亡细胞明显增多,0min开始出现凋亡细胞,随着时间的延长,凋亡数目逐渐增多,24h时凋亡细胞数目最多,CBI组与C8I组与IRI组一样,0min、15min、30min、2h、6h、12h、24h时间点的凋亡细胞数目呈增长趋势,但两抑制剂组的凋亡细胞数目与IRI组在同一时间点相比较明显减少(P<0.05),差异具统计学意义。4.使用Western blotting法检测脑缺血侧大脑中c

关键词：溶酶体脑缺血再灌注凋亡 Cathepsin B Caspase-8-Caspase-3凋亡信号通路 CA-074Me z-ietd-fmk

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