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水稻白叶枯病菌Ⅲ型分泌系统转位子的鉴定与效应因子xopn功能的研究

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水稻白叶枯病菌Ⅲ型分泌系统转位子的鉴定与效应因子XopN功能的研...

作者：刘少强南京农业大学

学位级别：硕士

水稻白叶枯病菌Xoo(Xanthomonas oryzfae ***,Xoo)能利用Ⅲ型分泌系统T3SS(Typethreesecretionsyetem)向细胞外分泌效应因子,从而表现出水稻白叶枯病菌的毒性。转位子是Ⅲ型分泌系统的重要组分,位于Ⅲ型分泌系统装置顶端,通常由两个疏... 详细信息

水稻白叶枯病菌Xoo(Xanthomonas oryzfae ***,Xoo)能利用Ⅲ型分泌系统T3SS(Typethreesecretionsyetem)向细胞外分泌效应因子,从而表现出水稻白叶枯病菌的毒性。转位子是Ⅲ型分泌系统的重要组分,位于Ⅲ型分泌系统装置顶端,通常由两个疏水性转位子蛋白和一个亲水性转位子蛋白组成。有研究显示,水稻白叶枯病菌Xoo的亲水性转位子蛋白Hpa1xoo和疏水性转位子蛋白HrpFxoo是Ⅲ型分泌系统的重要组分,它们影响着水稻白叶枯病菌PX099A在水稻上的致病性。因此使用GAL4和膜酵母双杂交系统验证Hpa1xoo和HrpFxoo两者间是否存在直接互作,结果表明,两种蛋白之间并不存在直接互作。设计实验将hpa1和hrpF基因分别连接到表达载体pHM1上,并在设计hpa1引物时加上flag标签,在设计hrpF引物时加上his标签,通过Western bloting实验显示蛋白表达正确。之后分别通过Hpa1-Flag蛋白和HrpF-His蛋白在PXO99A总蛋白中进行免疫共沉淀(CO-IP)实验,然后将免疫沉淀的互作结合蛋白样品送公司进行质谱鉴定。Hpa1-Flag样品在PX099A总蛋白中筛选到了 24种互作蛋白,HrpF-His样品在PX099A总蛋白中筛选到了 64种互作蛋白,其中包括Ⅲ型分泌系统效应蛋白xopn,后续进一步验证xopn对水稻白叶枯病菌致病性的影响。水稻白叶枯病菌胞外蛋白Xops(Xanthomonas outer proteins)是Xoo利用Ⅲ型分泌系统泌出到细胞外的一类蛋白质。xopn即为Xop蛋白的一种,是Xoo中Ⅲ型分泌系统的一个效应因子。目前xopn在水稻白叶枯病菌PX099A上的功能还未知。本研究采用同源交换方法敲除PXO99A菌株中的xopn基因,获得PX099A△xopn突变体菌株,在突变体菌株上回补xopn基因获得C-xopn回补菌株。通过对PX099AAxopn菌株的生长速度测定、致病力测定、过敏反应测定来研究xopn的病理功能。结果显示,缺失了 xopn的菌株在NB培养液中生长速度要小于野生型PX099A菌株的生长速度;缺失了xopn的菌株在IRBB208、Asminori、日本晴水稻品种上引起病斑长度相对于野生型PX099A要短,且xopn突变体菌株和野生型菌株的致病力有显著差异;回补了 xopn后能够恢复水稻白叶枯菌株PX099A在水稻上的致病力;另外,xopn突变体菌株相对于野生型PX099A在烟草上引起的过敏反应差异不显著。

关键词： Hpa1Xoo HrpFXoo 免疫共沉淀 xopn 致病力过敏反应

白叶枯病菌效应子xopn在拥有OsSWEET11同源基因的水稻品种上发挥毒性作用

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中国水稻科学 2020年第4期34卷 368-382页

作者：李丽莫旭艳李甜甜张丽媛董汉松山东农业大学植物保护学院山东泰安271018 南京农业大学植物保护学院南京210095 作物生物学国家重点实验室山东泰安271018

【目的】黄单胞菌细胞外泌蛋白质(Xanthomonas outer proteins,Xops)是植物病原黄单胞菌高度保守的毒性效应子或毒性辅助组分,通过细菌Ⅲ型分泌系统分泌到细菌细胞外部,然后转入植物细胞而发挥病理作用。水稻黄单胞菌水稻致病变种即水... 详细信息

【目的】黄单胞菌细胞外泌蛋白质(Xanthomonas outer proteins,Xops)是植物病原黄单胞菌高度保守的毒性效应子或毒性辅助组分,通过细菌Ⅲ型分泌系统分泌到细菌细胞外部,然后转入植物细胞而发挥病理作用。水稻黄单胞菌水稻致病变种即水稻白叶枯病菌的标准菌株PXO99^A分泌的xopn是一种毒性效应子,通过影响寄主免疫反应而使水稻发病。但是,xopn对病菌毒性的影响是否因水稻品种的不同而异,还有待研究。【方法】利用同源双交换技术,先敲除了PXO99^A的xopn基因,获得了Δxopn突变体,又经过遗传互补,得到了回补菌株Δxopn/xopn。通过营养肉汤液体培养,测定了xopn对病菌繁殖能力的影响;根据文献选用14个水稻品种,通过接种实验,测定了PXO99^A对这些品种的毒性与xopn敲除或回补的影响;在xopn发挥毒性作用的水稻品种上,测定了隐性抗病基因OsSWEET11/xa13与显性感病基因OsSWEET11/Xa13受病菌侵染而表达的情况,分析了xopn敲除或回补的影响。【结果】在营养肉汤液体培养过程中,病菌突变体菌株Δxopn的繁殖速度明显低于野生型PXO99^A。PXO99^A、Δxopn和Δxopn/xopn接种水稻后,根据其在水稻叶片组织内的繁殖量及随后产生的白叶枯病症状的严重程度,将供试的14个水稻品种分为两种情况。一是感病程度与病菌xopn是否敲除或回补无关,这有10个水稻品种(IRBB1、IRBB3、IRBB8、IRBB10、IRBB14、IR24、IRBB203、IRBB204、IRBB205和IRBB211),PXO99^A、Δxopn和Δxopn/xopn对它们的毒性无明显差别。二是xopn对病菌毒性发挥作用的水稻品种,包括高度感病的3个品种(IRBB208、Asominori和日本晴)和低感品种IRBB13。与PXO99^A或Δxopn/xopn相比,Δxopn对这4个水稻品种的毒性大为降低。在IRBB13上,病菌侵染对隐性抗病基因OsSWEET11/xa13在叶片内的表达发生抑制作用,这一效应与xopn的毒性功能相关。相反,日本晴显性感病基因OsSWEET11/Xa13却受病菌侵染的诱导,在叶片内的表达水平大幅度提高。IRBB208和Asominori携带OsSWEET11/Xa13同源基因,该同源基因在叶片内的表达水平也因病菌侵染而大幅提高。在这4个水稻品种上,PXO99^A和Δxopn/xopn能够诱导OsSWEET11/Xa13或其同源基因表达,但Δxopn无此作用。另外,xopn对病菌在非寄主植物烟草上诱发过敏反应有量变贡献,相比PXO99^A或Δxopn/xopn,Δxopn引起过敏反应的程度有所降低。【结论】xopn是一个有限广谱性效应子,在拥有OsSWEET11同源基因的水稻品种上发挥毒性作用。xopn也是病菌繁殖所需要的,对病菌在非寄主植物上诱导过敏反应有一定贡献。

关键词：水稻白叶枯病菌 xopn 细菌繁殖毒性 OsSWEET11

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黄单胞杆菌Ⅲ型效应子研究进展

中国农学通报 2011年第9期27卷 39-45页

作者：车晋英李岩强王春连赵开军中国农业科学院作物科学研究所/农业部作物遗传育种重点实验室/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程北京100081

许多黄单胞杆菌通过Ⅲ型分泌系统将效应子注入到寄主细胞中,引起寄主的免疫反应或感病。最近的研究提供了大量的关于Ⅲ型效应子作为致病因子或激发子同寄主互作的实验数据。笔者综述了黄单胞杆菌Ⅲ型效应子的分类及avrbs3、AvrRxv/YopJ... 详细信息

许多黄单胞杆菌通过Ⅲ型分泌系统将效应子注入到寄主细胞中,引起寄主的免疫反应或感病。最近的研究提供了大量的关于Ⅲ型效应子作为致病因子或激发子同寄主互作的实验数据。笔者综述了黄单胞杆菌Ⅲ型效应子的分类及avrbs3、AvrRxv/YopJ、xopn、XopD家族的主要功能,重点介绍了Ⅲ型效应子的酶活性功能在同寄主互作过程中发挥的重要作用,如XopD的SUMO化作用;AvrBs3家族效应子在调节寄主基因转录方面的作用;xopn抑制PAMP介导的植物免疫反应的功能等。论文还对一些研究深入的Ⅲ型效应子及其与寄主的互作进行了比较详细的评述,讨论Ⅲ型效应子的研究对于植物抗病基因工程的影响及重要意义,并对Ⅲ型效应子的研究方向进行了展望。

关键词： Ⅲ型效应子黄单胞杆菌 AvrBs3 XopD xopn

水稻白叶枯病菌Ⅲ型转位子组分及其抑制水稻抗病性的作用研究

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水稻白叶枯病菌Ⅲ型转位子组分及其抑制水稻抗病性的作用研究

作者：莫旭艳南京农业大学

学位级别：硕士

真核生物(动植物)病原革兰氏阴性细菌大部分致病因子和抗病性诱导或抑制因子属于Ⅲ型(type Ⅲ,T3)效应子,主要是蛋白质。细菌侵染动物或植物时,通过T3分泌途径将效应子分泌到细菌-寄主细胞界面。随即,病菌形成一种叫做T3转位子(T3 trans... 详细信息

真核生物(动植物)病原革兰氏阴性细菌大部分致病因子和抗病性诱导或抑制因子属于Ⅲ型(type Ⅲ,T3)效应子,主要是蛋白质。细菌侵染动物或植物时,通过T3分泌途径将效应子分泌到细菌-寄主细胞界面。随即,病菌形成一种叫做T3转位子(T3 translocon)的纳米级装置,将效应子转运到寄主细胞内,效应子得以发挥病理功能。T3转位子由多种转位子蛋白质(translocators)组成,已知动物病原细菌的T3转位子组分包括一种亲水性转位子和两种疏水性转位子。植物病原菌T3转位子的组分即T3这种蛋白质的数目和性质,一直不清楚。通过本研究,实验证明Hpa2、HrpF和xopn对PXO99A菌株中PthXo1效应子具有转运作用,是Xoo的转位子组分,并且它们能够进入水稻寄主细胞,不过进入水稻后只有xopn能抑制寄主植物防御反应。黄单胞菌细胞外泌蛋白质(Xanthomonas outer proteins,Xops)是植物病原黄单胞菌高度保守的毒性效应子或毒性辅助组分,其在细菌体内通过Ⅲ型分泌系统进行分泌,运输到细菌细胞外部,再进一步侵入植物细胞而发挥相关的病理作用。但目前关于Xop效应子的了解还比较贫乏,对不同Xops功能机制和其对不同水稻品种的病理反应以及特定的Xop发挥毒性作用的专化性程度都知之甚少。***2、HrpF和xopn同步执行效应子转运功能通过本实验室纪洪涛和王瑄对PXO99A菌株分泌的Hpa1进行研究,发现Hpal能够转运细菌PthXo1和AvrXa10两种T3效应子分别进入寄主日本晴和IRBB10中,鉴定Hpal为一种转位子。在此基础上,我们选取PXO99A菌株Hpa2、HrpF和xopn继续展开研究。通过构建相关突变体进行接种实验,发现Hpa2、HrpF和xopn是PXO99A不可或缺的毒性成分,在易感水稻品种上对PXO99A细菌毒性产生不同程度的影响,并且对PthXo1-Cya效应子分泌不起作用。通过测定菌含量和PthXo1-Cya转运情况,Hpa2、HrpF和xopn对PthXo1从细菌到水稻细胞的转运过程具有共同作用,都对PthXo1进行转运,PthXo1转运后激活了OsSWEET11的表达,其毒性作用在感病水稻品种上形成白叶枯病症状。然后构建PXO99A菌株Hpa2、hrpF和xopn单基因,双基因和三基因敲除突变体,通过接种日本晴植株比较PthXo1的转位水平发现Hpa2、HrpF和xopn三个转位子协同介导PthXol转运。最后通过分析转位子的分泌和转运以及细菌毒性研究,证实了 Hpa2-Cya,HrpF-Cya和xopn-Cya是通过细菌T3途径分泌并进入水稻细胞,xopn还能抑制受侵染易感水稻品种的防御反应,但是Hpa2和HrpF没有类似抑制作用。这表明T3转位子的不同成分除了介导细菌效应子转运的共同功能外,还具有独特的毒性机制。2.黄单胞菌xopn在拥有OsSWEET11同源基因的水稻品种上发挥毒性作用水稻白叶枯病菌PXO99A分泌的xopn是一种通过影响寄主免疫反应而使水稻发病的毒性效应子。本实验室胡立曾对xopn是否因寄主水稻品种的不同而造成病原菌毒性的差异进行了初步的实验探索,发现PXO99A菌株xopn在不同水稻品种上存在毒性差异,并且会影响烟草的过敏反应。在该研究的基础上,我们进行更深入的研究,同时也对之前的结果加以验证。本实验利用同源双交换技术得到PXO99A菌株xopn基因单敲除突变体Δxopn,再利用遗传互补技术得到其回补xopn基因的菌株。将相关菌株通过在NA液体培养基中进行培养发现xopn影响细菌的繁殖速度;用PXO99A、Δxopn、ΔopN/xopn对14个供试水稻品种进行接种,依据接种不同水稻品种后引起叶片内细菌繁殖量和白叶枯病症状进行评价,结果显示xopn基因敲除对Xoo毒性的影响与水稻品种有关,并且因为水稻品种的不同而呈现较大差别,仅有IRBB13、IRBB208、Asominori、日本晴4个水稻品种的病理反应受病菌效应子xopn的影响;PXO99A在IRBB13上的毒性作用比较低,但xopn对病菌毒性发挥较大作用;而PXO99A对日本晴、Asominori、IRBB208三个水稻品种具有很强的毒性,但xopn对病菌毒性发挥的作用比较小;通过接种实验和实时荧光定量分析发现xopn基因可以促进病菌对显性基因OsSWEET11表达和抑制对隐性基因OsSWEET11的表达;通过烟草HR实验,xopn基因的敲除会减慢HR反应的发生。通过这些实验结果可以得出:xopn是一个有限广谱性效应子,能够对含有OsSWEET11同源基因的水稻品种发挥毒性作用;同时xopn也对病菌繁殖和病菌在非寄主植物上诱导过敏反应具有一定作用。

关键词： T3转位子 Hpa2 HrpF xopn 效应子 OsSWEET11

水稻条斑病菌GX01 non-TAL效应物功能的初步研究

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水稻条斑病菌GX01 non-TAL效应物功能的初步研究

作者：李建媛广西大学

学位级别：硕士

水稻细菌性条斑病(Bacterial leaf streak of rice,BLS)是世界范围内最具破坏性的水稻细菌性病害之一,对水稻质量、产量造成极大的威胁。稻生黄单胞菌条斑致病变种(Xanthomonas oryzae ***,Xoc)是水稻细菌性条斑病的病原菌。Ⅲ型分泌系... 详细信息

水稻细菌性条斑病(Bacterial leaf streak of rice,BLS)是世界范围内最具破坏性的水稻细菌性病害之一,对水稻质量、产量造成极大的威胁。稻生黄单胞菌条斑致病变种(Xanthomonas oryzae ***,Xoc)是水稻细菌性条斑病的病原菌。Ⅲ型分泌系统广泛分布于革兰氏阴性细菌种类以及大多数植物病原细菌中,对植物病原细菌的致病性起着十分重要的作用。Xoc的Ⅲ型效应物主要分为两大类,TAL效应物(transcription activator-like effectors,TALEs)和 non-TAL 效应物(non transcription activator-like effectors,non-TALEs)。研究表明non-TAL效应物对病原菌在宿主上的毒力、生长发挥着重要作用,它们主要通过利用自身的分子生化功能来调控植物的免疫。Xoc GXO1是从广西贺州条斑病发病稻区分离筛选到的一株高致病菌株,本实验室前期完成了Xoc GXO1的全基因组测序和基因注释工作,在Xoc GXO1中注释了 25个non-TAL效应物,之后构建了其中24个non-TAL效应物的突变体,发现xopn和AvrBs2两个效应物对Xoc GX01毒力起着决定性作用,并且发现xopn与水稻OsZK蛋白存在互作关系。但是这25个non-TAL 效应物的具体功能以及 xopn 的致病分子机理尚不明确。因此本研究在前期研究基础上通过一系列实验对Xoc GX01中的non-TAL效应物功能进行了初步探索:(1)本研究通过检测被不同菌株侵染的水稻叶片的活性氧及程序性细胞死亡,发现non-TAL效应物XopAA、XopAB、XopAF、XopC2、XopI、XopL、xopn、XopO、XopQ、XopR、XopU、XopX、XopY、XopZ1可能诱发水稻叶片中H202的产生。non-TAL效应物XopAJ、XopAF、XopAK、XopC2、XopP-1、XopV可能抑制水稻叶片的程序性细胞死亡。(2)本研究通过构建OsZK的分段缩短片段,发现xopn与OsZK的第1-6个WD40结构域在酵母双杂系统中存在互作关系。(3)本研究还通过分析分别侵染了 Xoc GX01野生型和GX01Δxopn菌株的水稻日本晴转录组,发现有199个基因的表达量发生了显著变化,显示Xoc GX01可能通过利用xopn抑制类钙调蛋白从而抑制水稻的气孔关闭,使Xoc GX01能够通过气孔侵染水稻,并且可能利用xopn促进水稻光合作用以满足自身营养需求从而在水稻中成功繁殖。总之,本研究为Xoc GX01 non-TAL效应物功能的深入研究奠定了基础,也为培育水稻条斑病抗性品种提供了线索。

关键词：水稻条斑病菌 Xoc GXO1 non-TAL效应物活性氧 xopn