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Evaluation of antibiotic activity produced by Pseudomonas aeruginosa LV strain against xanthomonas arboricola ***

Agricultural Sciences 2014年第1期5卷 71-76页

作者： Fernanda Corrêa da Silva Vasconcellos Admilton Gonçalves de Oliveira Lucilene Lopes-Santos Jamile Priscila de Oliveira Beranger Martha Viviana Torres Cely Ane Stefano Simionato Juliana Fonteque Pistori Flavia Regina Spago João Carlos Palazzo de Mello Juca Abramo Barrera San Martin Celia Guadalupe Tardeli de Jesus Andrade Galdino Andrade Departamento de Microbiologia Laboratório de Ecologia MicrobianaUniversidade Estadual de LondrinaLondrinaBrazil Departamento de Farmácia e Farmacologia Laboratório de Produtos FitoterápicosUniversidade Estadual de MaringáMaringáBrazil Departamento de Biologia Geral Laboratório de Microscopia e MicroanáliseUniversidade Estadual de LondrinaLondrinaBrazil

Bacterial spot caused by xanthomonas arboricola pv. pruni (Xap) is considered as a major problem in peach orchards. Copper and antibiotics are used to control, and biocontrol should be a new alternative with low environment impact. The objective was evaluated by the antibiotic activity of the metabolite produced by Pseudomonas aeruginosa LV strain. The free cells supernatant was fractionated with a serial organic solvent with crescent polarity and a dichloromethane phase was concentrated and lyophilised, and after was fractionated using vacuum liquid chromatography. The antibiotic activity of the F3 fraction containing an organometallic compound was tested on Xap in vitro and in a greenhouse conditions. Plants were sprayed with F3 before or after Xap infection and the results showed changes in exopolysaccharides and cell morphology. The F3 concentration of 450 μg·mL-1 was more effective. The results showed that F3 fraction could be a new alternative to control bacterial spot.

关键词： Peach Tree Bacterial Spot Biological Control Leaf Lesions xanthomonas arboricola pv.pruni

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桃细菌性穿孔病病原鉴定、分子检测及其防治研究

桃细菌性穿孔病病原鉴定、分子检测及其防治研究

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作者：罗梅华中农业大学

学位级别：硕士

近年来,桃细菌性穿孔病已经上升为我国桃树上的主要病害之一,严重威胁桃产业的健康发展。目前关于该病的病原种群结构、流行学及防控措施等均研究较少,增加了该病害的防控难度。本研究从我国主要桃产区进行了病样采集、病原菌分离及鉴定... 详细信息

近年来,桃细菌性穿孔病已经上升为我国桃树上的主要病害之一,严重威胁桃产业的健康发展。目前关于该病的病原种群结构、流行学及防控措施等均研究较少,增加了该病害的防控难度。本研究从我国主要桃产区进行了病样采集、病原菌分离及鉴定,明确了引起我国桃细菌性穿孔病的病原。通过rep-PCR和ISSR-PCR分子标记解析病原菌群体遗传多样性,开发出相应的病害早期检测技术,同时开展了田间防治试验,为桃细菌性穿孔病防控提供理论依据和实际指导。主要研究结果如下:(1)从我国主要桃产区12省17市共分离到675株细菌,通过16S r DNA序列分析主要鉴定到14.5%xanthomonas species和84%Pantoea species两类细菌;对两类细菌进行柯赫氏法则验证,表明xanthomonas species细菌能引起典型的穿孔症状,为桃细菌性穿孔病的致病菌;对xanthomonas species细菌进行形态学观察、Biolog微生物系统表型鉴定、ftsx基因PCR专化性鉴定以及多基因联合系统发育分析,98株xanthomonas species细菌全部被鉴定为xanthomonas arboricola ***(Xap)。因此,明确了引起我国桃细菌性穿孔病的病原菌为Xap。(2)通过rep-PCR和ISSR-PCR标记分析Xap病菌群体遗传多样性。结果表明,多态性百分比PPL为80.99%,遗传分化系数Gst为0.5626,基因流Nm为0.3888,预示Xap种群内部具有丰富的遗传变异。基于NJ聚类图、Pco A主成分分析、STRUTURE遗传结构分析等系统发育分析表明我国Xap群体内部相似性较高(65%),但不同地理种群之间存在明显的遗传分化(HBZY和HBJM种群)。基于DAPC判别分析、AMOVA分子变异分析等类群分析表明不同寄主来源(核桃、桃和李)***之间存在明显的寄主专化性,但不同地理来源的Xap内部专化性较弱,变异主要存在于种群内(56%)。(3)建立基于RPA/Cas12a系统的Xap检测方法。选择Xap专化性基因ftsx为本检测技术的候选靶标,设计3对RPA引物测试反应专化性,结果表明RPA1F/RPA1R引物能够稳定且专一地检测出Xap,可用于后续RPA反应。基于RPA1F/RPA1R引物的靶向区域设计了3个crRNA进行Cas12a裂解反应,结果显示crRNA2能够稳定地引导Cas12a降解靶向ds DNA和非专化性ss DNA,可用于后续裂解反应。设计两种不同形式的报告探针实现可视化检测,即FQ-reporter介导的荧光信号和FB-reporter介导的横向流动检测试纸条。其中,基于FQ-reporter荧光报告探针的核酸检测通过微型紫外手电筒实现可视化,其检测灵敏度低至10M(8.855fg/μL)Xap基因组DNA;基于FB-reporter的生物素探针检测通过试纸条实现可视化,灵敏度可达10M(88.55fg/μL)Xap基因组DNA。专化性评价显示2种检测方法均能够从常见桃树病原菌DNA及与Xap相似度较高的其他杂菌中专化性地检测出Xap。最后,将该技术与基于Na OH溶液的DNA粗提取(3 min)相结合,进一步简化出从叶片病斑到诊断结果的一体化检测程序。对人工接种发病叶片及自然发病的穿孔叶片检测结果表明,简化的检测方法仍能准确、高效地检出阳性结果,且整个过程只需要37℃孵育1 h左右,不依赖任何复杂仪器。综上,本研究开发出了一种灵活、有效、简便的Xap检测方法,有望广泛应用于田间桃细菌性穿孔病的早期诊断及监测。(4)结合室内抑菌活性测定和2年2试验地的平行重复田间试验,明确了可杀得对桃细菌性穿孔病具有最优的防治效果。倍数稀释为1:800时,防效可达90%以上,倍数稀释为1:2000时防效也可达70%以上,并且使用倍数稀释为1:2000时基本可消除Cu积累带来的植物毒性,在田间可以使用。抗生素类杀菌剂在室内显示很高的杀菌活性(EC=0.04-2.06μg/m L),但田间使用效果不稳定(2019-2020年荆门),仅能够起到延缓病情发展的作用。总体上,保护性杀菌剂可杀得、代森锰锌等比治疗性杀菌剂中生菌素等防治效果好。

关键词：桃细菌性穿孔病 xanthomonas arboricola pv.pruni 遗传多样性 RPA/Cas12a系统田间防治杀菌剂

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桃穿孔病病原菌的分离与鉴定

桃穿孔病病原菌的分离与鉴定

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作者：王程安中国农业科学院

学位级别：硕士

桃(Prunus persica L.)是重要的经济作物,在世界范围内广泛种植。然而,桃树在生长繁育过程中,易遭受各种病原物的危害,可造成严重的经济损失。近几年,桃穿孔病(Peach shot-hole disease)在我国各大桃产区均有发生,并且随着气候变暖,该... 详细信息

桃(Prunus persica L.)是重要的经济作物,在世界范围内广泛种植。然而,桃树在生长繁育过程中,易遭受各种病原物的危害,可造成严重的经济损失。近几年,桃穿孔病(Peach shot-hole disease)在我国各大桃产区均有发生,并且随着气候变暖,该病害的发生愈加普遍,可能会造成重大的经济损失。桃穿孔病分为细菌性穿孔病和真菌性穿孔病,目前我国各桃产区中桃穿孔病的病原种类尚不明确,这增加了病害诊断和防控的难度。本研究对我国各大桃产区中桃穿孔病的发生情况进行了初步调查,并通过病原菌的分离与鉴定明确了各大桃产区中桃穿孔病的致病菌,主要研究结果如下:1.桃穿孔病的病样采集。通过调查发现桃穿孔病在我国的辽宁大连、北京平谷、河北昌黎、山东泰安、浙江临海、浙江嘉兴、陕西西安和福建福州8个桃产区中均有发生,采集上述地区的桃穿孔病样品共计60份。2.病原真菌的分离与鉴定。通过病原真菌的常规分离方法,共分离获得108株真菌菌株。根据形态学特征和ITS rDNA序列,将108株真菌菌株归为F16六类,并分别鉴定为Alternaria sp.、Fusarium sp.、Colletotrichum sp.、Colletotrichum sp.、Diaporthe sp.和Phoma sp.。通过针刺接种的方式将6类真菌接种至离体的桃树叶片和枝条,结果表明,6类真菌菌株均不能在桃树的离体叶片和枝条引起桃穿孔病的症状。3.病原细菌的分离与鉴定。通过病原细菌的分离、纯化共获得60株细菌菌株,经形态学鉴定、16S rDNA及生理生化测定,将60株细菌菌株鉴定为树生黄单胞菌桃李致病变种xanthomonas arboricola ***(Xap)。将分离获得的60株Xap菌株作为疑似致病菌进行致病性测定,结果表明60株Xap菌株均可诱导烟草叶片发生过敏性反应,并且在温室实生桃苗上引起的症状与田间自然发病的症状相一致。采集病叶进行病原菌的再分离与鉴定,形态学鉴定和16S rDNA测序结果表明再分离菌株与原始接种菌株为同一种。以上结果说明,Xap是引起我国桃主产区中桃穿孔病的主要致病菌。总之,本研究通过调查发现了我国8个桃主产区中均有桃穿孔病的发生,进一步明确了该病害在我国的发生分布情况。通过病原菌的分离与鉴定明确了我国桃主产区的桃穿孔病为细菌性穿孔病,致病菌为Xap,为有效防控该病害提供了理论依据。

关键词：桃穿孔病病原鉴定 xanthomonas arboricola pv.pruni 细菌性穿孔病

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