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人血清白蛋白及其复合物的结构基础

化学进展 2013年第4期25卷 530-538页

作者：杨峰梁宏广西师范大学药用资源化学与药物分子工程国家重点实验室培育基地桂林541004 广西师范大学化学化工学院桂林541004

人血清白蛋白是人体中一种最丰富的血浆蛋白质,是主要的脂肪酸和外源性分子如药物等的转运载体。由于大多数药物需要结合白蛋白被运输到靶组织和器官,白蛋白对于药物的代谢动力学和递送起到关键作用。40多年来,白蛋白与小分子化合物的... 详细信息

人血清白蛋白是人体中一种最丰富的血浆蛋白质,是主要的脂肪酸和外源性分子如药物等的转运载体。由于大多数药物需要结合白蛋白被运输到靶组织和器官,白蛋白对于药物的代谢动力学和递送起到关键作用。40多年来,白蛋白与小分子化合物的相互作用一直是国内、外的研究热点。此外,白蛋白作为药物载体被广泛地研究和应用。因此,本文将从蛋白质结构层面上综述白蛋白和白蛋白复合物的相关知识,提出白蛋白相关研究领域的一些未来挑战。

关键词：人血清白蛋白人血清白蛋白-药物复合物蛋白质晶体结构 x-射线晶体学

恒河猴MHC-I类分子Mamu-A^＊02与猴免疫缺陷病毒抗原表位复合物的纯化和晶体学分析

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生物工程学报 2009年第7期25卷 1028-1034页

作者：戴连攀周斌齐建勋马颖高福杨希才中国科学院微生物研究所北京100101 中国科学院研究生院北京100039

恒河猴是研究人免疫缺陷型病毒(HIV)感染与获得性免疫缺失综合征(AIDS)疫苗研制的最为重要的动物模型,其组织相容性复合体(MHC)结构的解析将有助于了解HIV免疫逃逸机制。本研究克隆了1个恒河猴MHC-I类分子Mamu-A*02轻链(β2m)基因并插入... 详细信息

恒河猴是研究人免疫缺陷型病毒(HIV)感染与获得性免疫缺失综合征(AIDS)疫苗研制的最为重要的动物模型,其组织相容性复合体(MHC)结构的解析将有助于了解HIV免疫逃逸机制。本研究克隆了1个恒河猴MHC-I类分子Mamu-A*02轻链(β2m)基因并插入到pET21a(+)原核表达载体中,成功构建了重组表达质粒pET21a(+)-Mamu-β2m。pET21a(+)-Mamu-β2m和之前构建好的恒河猴Mamu-A*02重链(α)重组质粒pET21a(+)-α分别转入BL21(DE3)大肠杆菌表达体系中,IPTG诱导表达。Mamu-A*02重链和猴β2m目的蛋白在BL21(DE3)中以包涵体形式表达。重链、轻链的包涵体蛋白和Mamu-A*02限制的猴免疫缺陷病毒(SIV)Nef表位多肽(YY9)通过稀释法共复性。高纯度的复合物蛋白经分子筛层析和阴离子交换层析纯化后获得。复合物晶体利用悬滴法筛选并优化,并在0.1mol/LBIS-TRIS(pH5.5)、2.0mol/L(NH4)2SO4条件下收集一套2.8?分辨率的x-射线衍射数据。晶体属于正交空间群P212121,其晶胞参数为a=128.99?,b=129.01?,c=129.03?,α=β=γ=90°。该数据可通过分子置换法解析。

关键词：猴免疫缺陷病毒(SIV) Mamu-A^02-Nef_YY9复合体蛋白表达与纯化 x-射线晶体学

鸡白细胞介素18与其受体复合物的表达、纯化与初步晶体学研究

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生物物理学报 2013年第5期29卷 327-337页

作者：钱云魏晖王新泉清华大学生命科学学院北京100084

白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)是IL-1家族中一种重要的细胞因子,在增强免疫、抗肿瘤等方面具有潜在应用价值。鸡IL-18(chicken interleukin-18,chIL-18)的cDNA于2000年被克隆,后续研究证明鸡IL-18与哺乳动物IL-18具有类似的生物... 详细信息

白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)是IL-1家族中一种重要的细胞因子,在增强免疫、抗肿瘤等方面具有潜在应用价值。鸡IL-18(chicken interleukin-18,chIL-18)的cDNA于2000年被克隆,后续研究证明鸡IL-18与哺乳动物IL-18具有类似的生物学功能。IL-18可与靶细胞上的IL-18受体(IL-18R,包括IL-18Rα和IL-18Rβ)特异性结合形成受体复合物,介导细胞膜上的信号从胞外向胞内传递。作者在大肠杆菌中成功表达和纯化了chIL-18,利用昆虫细胞表达系统获得了chIL-18Rα和chIL-18Rβ的胞外结构域;他们还在体外重组并纯化了chIL-18/18Rα二元复合物与chIL-18/18Rα/18Rβ三元复合物,并生长出二元复合物晶体。这些工作为进一步测定chIL-18与其受体复合物的晶体结构,从而深入探讨chIL-18信号转导机制奠定了基础。

关键词：鸡IL-18 鸡IL-18受体配基受体复合物 x-射线晶体学

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单克隆抗体表位分析技术的研究进展

中国生物制品学杂志 2018年第5期31卷 555-562页

作者：赵晓瑞毛晓燕兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃兰州730046

单克隆抗体具有高度均一性及对靶分子的高亲和性、特异性,已广泛应用于自身免疫性疾病、炎性疾病和癌症的治疗。单克隆抗体与相应抗原的反应性决定于其所识别的抗原表位,确定相应表位在抗原结构上的位置是单克隆抗体筛选中的关键步骤。... 详细信息

单克隆抗体具有高度均一性及对靶分子的高亲和性、特异性,已广泛应用于自身免疫性疾病、炎性疾病和癌症的治疗。单克隆抗体与相应抗原的反应性决定于其所识别的抗原表位,确定相应表位在抗原结构上的位置是单克隆抗体筛选中的关键步骤。本文主要对几种单克隆抗体表位的分析方法,包括ELISA法、生物酶解法及化学切割法、噬菌体随机肽库、x-射线晶体学、丙氨酸扫描、氢氘交换质谱(hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry,HDx-MS)、生物信息学表位预测方法的原理、特点及研究进展作一综述。

关键词：单克隆抗体抗原表位酶联免疫吸附试验噬菌体随机肽库 x-射线晶体学丙氨酸扫描氢氘交换质谱生物信息学

脂肪酸调控盐酸金刚烷结合在人血清白蛋白ⅡA亚域(英文)

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广西师范大学学报（自然科学版） 2012年第3期30卷 159-170页

作者：梁宏广西师范大学药用资源化学与药物分子工程国家重点实验室培育基地广西桂林541004 广西师范大学化学化工学院广西桂林541004

人血清白蛋白是血液中最丰富的蛋白质,被利用来结合和运输许多不同类的内源和外源化合物。阴离子药物可以随意地结合在白蛋白的ⅡA亚域,而大多数阳离子药物却很难结合在该区域。本研究通过脂肪酸改变白蛋白进而调控阳离子药物结合在白... 详细信息

人血清白蛋白是血液中最丰富的蛋白质,被利用来结合和运输许多不同类的内源和外源化合物。阴离子药物可以随意地结合在白蛋白的ⅡA亚域,而大多数阳离子药物却很难结合在该区域。本研究通过脂肪酸改变白蛋白进而调控阳离子药物结合在白蛋白ⅡA亚域。本文以具有抗病毒和抗帕金森病功效的盐酸金刚烷为例,体外研究结果表明过度的脂肪酸化白蛋白能够有助于稳定金刚烷与白蛋白相互作用。x-射线结晶学数据进一步阐明了该调控的结构机制。此外,本文的结构数据表明具有羧基的阴离子药物也许可以调控金刚烷与白蛋白相互结合。最终,本文从结构方面洞察了金刚烷与白蛋白相互结合的这种新颖方式,这将提供诱人的可能性去全方位开发独特的白蛋白ⅡA亚域的结合能力,致使白蛋白能够同时运输阴离子和阳离子药物。

关键词：人血清白蛋白盐酸金刚烷脂肪酸荧光光谱 x-射线晶体学

核受体FxR与激动剂复合物的结构生物学研究

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核受体FXR与激动剂复合物的结构生物学研究

作者：李家安哈尔滨工业大学

学位级别：硕士

21世纪以来,以糖尿病与肥胖症为代表的代谢性疾病的发病率显著升高,对于这些疾病的研究也在逐年增加。胆汁酸是调节机体营养吸收,糖类与脂质代谢的重要生理因子。维持胆汁酸稳态对于维持机体代谢稳态与预防机体代谢紊乱具有重要意义。... 详细信息

21世纪以来,以糖尿病与肥胖症为代表的代谢性疾病的发病率显著升高,对于这些疾病的研究也在逐年增加。胆汁酸是调节机体营养吸收,糖类与脂质代谢的重要生理因子。维持胆汁酸稳态对于维持机体代谢稳态与预防机体代谢紊乱具有重要意义。法尼醇x受体FxR作为机体主要的胆汁酸受体,广泛分布于肝脏,小肠等与胆汁酸代谢密切相关的器官中,一方面在胆汁酸代谢途径中扮演了重要角色,另一方面也在脂质代谢,葡萄糖代谢等方面起到了关键作用。基于上述特征,FxR具有成为相关代谢疾病的新型药物靶点的潜质。FxR在胆汁酸代谢中主要通过对相关蛋白的表达水平进行调节,从而参与了以下机制的调控:抑制胆汁酸代谢核心限速酶CYP7A1的表达,降低肝脏中胆汁酸的合成;上调肝脏中分泌载体胆汁酸流出转运蛋白BSEP的表达,促进肝脏中胆汁酸的分泌;下调肝脏中重吸收载体牛磺胆酸钠共转运多肽NTCP与有机阴离子转运多肽OATP的表达,抑制肝脏中胆汁酸的重吸收过程;下调肠道中重吸收载体胆汁酸转运蛋白ASBT的表达,抑制肠道中胆汁酸的重吸收过程。同时也有研究表明,FxR的小分子配体药物有助于改善各类代谢疾病的症状,包括非酒精性脂肪肝,二型糖尿病,肥胖症和胆汁淤积症等。本文中,我们首先通过原核表达的手段对FxR-LBD蛋白片段进行表达,而后通过镍柱亲和层析,凝胶过滤层析与离子交换层析等手段纯化获得了FxR蛋白。通过筛选与优化,获得了一批FxR蛋白与小分子的共晶,并通过x射线衍射对其结构进行了解析。对FxR与不同小分子激动剂的复合物结构进行解析,有利于进一步了解和认识FxR与小分子激动剂间的作用机理,有助于相关组织特异性FxR激动剂药物的开发与应用。

关键词：法尼醇x受体激动剂胆汁酸代谢 x-射线晶体学

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STING蛋白的初步晶体学研究

STING蛋白的初步晶体学研究

作者：张俊兵山东大学

学位级别：硕士

STING蛋白是天然免疫一型干扰素生成通路中的一个衔接调控蛋白,在细菌、病毒和真核病原菌的所引起的天然免疫反应中都发挥着重要的调控作用[1]。近来研究发现,STING可以作为免疫感受器识别结合来自病原菌中的第二信使分子c-di-GMP而激... 详细信息

STING蛋白是天然免疫一型干扰素生成通路中的一个衔接调控蛋白,在细菌、病毒和真核病原菌的所引起的天然免疫反应中都发挥着重要的调控作用[1]。近来研究发现,STING可以作为免疫感受器识别结合来自病原菌中的第二信使分子c-di-GMP而激活下游通路。之前的研究预测STING蛋白要包含一个预测的N端五次跨膜部分（1-173aa）和C端胞内可溶性的胞质结构域（174-379aa）。有关N端的功能目前仍不清楚,可能与其在细胞内的定位有关,如之前的研究中发现其可能定位于线粒体或内质网膜上。C端胞质结构域（C-terminal domain,CTD）可通过募集相互作用分子而发挥重要的信号调控作用。STING蛋白的氨基酸序列与PDB中任何已知结构的蛋白质都没有同源性,预示它可能拥有独特的三维结构。为闸述STING接受c-di-GMP信号而发挥功能的分子机制,我们利用x-射线晶体学方法对其进行了结构生物学的研究。首先,通过对不同STING蛋白的片段在大肠杆菌内的表达分析,我们得到了其可溶性的C端胞质结构域片段（149位氨基酸到379位氨基酸）,命名为STINGCTD。然后利用座滴法进行晶体普筛工作,最后在14.4%PEG3350,0.08M二甲砷酸钠（PH=6.5）和0.16M氯化钙和20%（v/v）甘油条件下长出了晶体。由于坐滴法普筛中得到的晶体难以达到x-射线衍射及结构解析的要求,因此我们用悬滴法对STINGCTD蛋白进行了晶体的优化工作。主要通过以下几个方面：一是将晶体生长条件中的缓冲液PH和沉淀剂浓度在上述条件附近进行拉梯度;二是在晶体生长缓冲液中加入不同种类的additive和detergent;三是降低晶体生长的温度,在4度下进行晶体的优化培养：四是将晶体进行乙酸锂脱水处理。最终我们获得了适合x-射线晶体衍射并具有较高衍射分辨率的单晶,并在上海同步辐射中心收到了一套2.2A的衍射数据。初步处理结果表明STINGCTD的晶体属C222空间群,每个非对称单位中含有一个STINGCTD蛋白分子,陔分子与另一对称相关的分子形成一同源二聚体。由于STING蛋白在PDB数据库中没有具有较高同源性的蛋白质结构（大于30%）,因此我们考虑用STING蛋白的硒代衍生物来解决晶体结构解析中的相位求解问题。我们在native蛋白普筛长出晶体的条件中直接进行硒代衍生物晶体的优化培养,最终通过利用native蛋白的晶体进行种晶（seeding）的方法获得STlNGCT硒代衍生物的单晶,并在上海同步辐射中心收到了一套2.70A的数据SeMet-STINGCTD的晶体属P2空间群,每个非对称单位也仅含有一个SeMet-STINGCTD蛋白分子，该分子与另一对称相关的分子形成同源二聚体，利用单波长反常散射发（SAD）法解析的apo-STINGCTD结构中，STINGCTD以对称二体的形式存在，以V型结构存在，文献中预测的第五段长α螺旋其实并不是跨膜列，而是作为STING（?）包质结构域的组成部分参与二聚体相互作用界面的形成，并在二聚体内部参与形成疏水核心，该结构是一种全新的折叠形式由于解析的apo-STINGCTD结构中，STINGCD以同源二聚体（dimer）的形式存在。为了验证STINGCTD二聚体的形成并不是晶体堆积所造成的一种人为结果，因此我们利用凝胶过滤层析法对STINGCTD蛋白在没有和加入c-di-CMP的情况下的分子大小。结果表明，STING蛋白大溶液中是以同源二聚体的形式存在，并且不受e-di-GMP的调控。另外，我们利用等温滴定量热法检测了STINGCTD与c-di-GMP的亲和力，其解离常数Kd值为3.70uM,复合物中STINGCTD与c-di-CMP（?）的化学计量数之比为2：1，即一分子的c-di-GMI结合两分子的STINGCTD,这与之前的研究结果相一致。为了阐述STINGCTD识c-di-GMP的分子机制，我们对STINGCTD与c-di-GMP的复合物进行了晶体的优化培养，并最终收到了一套2.40A的数据，通过对衍射数据的初步分析，我们发现，c-di-GMP结合的STINGCTD复合物晶体属P212121空间群，相非对称单位中含有两个STINGCTD分子与一个cdi-GMP分子。

关键词： STING蛋白 x-射线晶体学蛋白质结构 c-di-GMP

Arginine-Agmatine反向膜转运蛋白AdiC的结构与功能研究

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Arginine-Agmatine反向膜转运蛋白AdiC的结构与功能研究

作者：焦绪瑶山东大学

学位级别：硕士

生物体内负责转运氨基酸、多胺及金属阳离子有机物（amino acid /polyamine/organocation, APC）的一系列膜转运蛋白是一个超家族,AdiC是该APC超家族中的代表成员。AdiC是Arginine-Agmatine的反向膜转运蛋白（Antipoter）,它在抗酸性的... 详细信息

生物体内负责转运氨基酸、多胺及金属阳离子有机物（amino acid /polyamine/organocation, APC）的一系列膜转运蛋白是一个超家族,AdiC是该APC超家族中的代表成员。AdiC是Arginine-Agmatine的反向膜转运蛋白（Antipoter）,它在抗酸性的过程中起着重要的作用。在极酸性环境中,AdiC会吸收环境中的Arg+进入细胞内,同时将细胞内的Agm2+输送到细胞外,伴随着这个过程会释放一个氢离子,从而可以维持细胞内正常的pH值。本论文主要是基于E. coli内膜反向转运蛋白AdiC野生型蛋白结构的分析研究,设计不同的定点突变,通过等温滴定量热（ITC）技术,检测这些突变蛋白和底物结合的能力,通过底物转运实验,检测这些突变蛋白转运底物的能力。通过对不同AdiC突变体的生化与结构分析,可以认为突变体蛋白AdiC-N22A既提高了蛋白与底物的结合能力又没有太大降低蛋白的转运活性,可以选择其作为目的蛋白,以研究其与底物Arg相结合的三维结构。利用x-光衍射射线晶体学技术获得了大肠杆菌AdiC-N22A蛋白与底物Arg结合（3.0 A）状态下的高分辨率结构。与野生型AdiC蛋白结构相比,与Arg结合的AdiC呈现出一种紧缩的状态,这主要是由Arg与AdiC结合诱发第6个跨膜螺旋发生显著的位置变化,同时,第2和第10个跨膜螺旋也发生位置变化。带正电的Arg处于电负性的酸性空腔中,Arg的头部与AdiC蛋白的主链原子形成氢键,碳链部分与高度保守残基的疏水侧链相互作用。通过对突变体和野生型AdiC蛋白结构的分析及比较所获得的相应的生化数据,我们发现了AdiC结构中的一些氨基酸（如E208,W202,W293,Y93,Y365等）在底物转运过程中起着重要的作用,这些氨基酸残基在物质运输过程中构成一个潜在的三道门,它们有可能参与底物Arg-Agm的转运。由此提出了一个可能的AdiC转运底物的分子机制的假说。

关键词：膜转运蛋白AdiC 膜蛋白结晶 x-射线晶体学

海洋微生物来源α-淀粉酶AmyP的结构与功能初探

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海洋微生物来源α-淀粉酶AmyP的结构与功能初探

作者：余继刚安徽大学

学位级别：硕士

α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中,能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等,是工业中应用最为广泛的酶制剂之一。构成α-淀粉酶家族的水解酶和转移酶是多结构域蛋白,他们共同的特点是都包含一个(α/β)8-barrel式催化结... 详细信息

α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中,能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等,是工业中应用最为广泛的酶制剂之一。构成α-淀粉酶家族的水解酶和转移酶是多结构域蛋白,他们共同的特点是都包含一个(α/β)8-barrel式催化结构单元,且活性位点位于p-折叠链的C末端。虽然α-淀粉酶都有一个共同的催化结构域及催化机制,但蛋白序列同源性分析发现α-淀粉酶可以被归属于3个不同的糖苷转移酶及水解酶家族—GH13、GH70和GH77。每个α-淀粉酶都包含有一个谷氨酸和两个天冬氨酸作为其必须的活性位点残基,同时其中大部分都有两个组氨酸保证其构象变换过渡态的稳定性。这五个氨基酸残基在整个a-淀粉酶家族中保守地存在于4段短的氨基酸序列中,且酶的特异性也都与这些氨基酸残基相关。本课题所研究的AmyP是从海洋微生物宏基因组中获得的一个能降解生淀粉的α-淀粉酶,它同已知的糖苷水解酶序列一致性和相似性很低,被归为一个新的糖苷水解酶亚家族GH137。值得注意的是AmyP表现出优先降解生大米淀粉颗粒的特性,这是α-淀粉酶家族中第一次报道的有此特性的酶。在本课题中,全长AmyP基因已被成功克隆重组至表达载体并转化入大肠杆菌异源表达。纯化后的重组AmyP在底物类似物β-环糊精存在的条件下进行了结晶,对所获单晶进行x-射线衍射得到了分辨率达2.1A的数据。初步晶体学分析结果显示,AmyP可能以二聚体形式行使功能,AmyP/β-环糊精晶体结构的空间群为P21212,晶胞参数为：a=129.824A,b=215.534A,c=79.699A,α=90°,β=90°,γ=90°。在α-淀粉酶家族中有约10%的成员包含一个非催化模块,这个模块有助于酶结合和降解生淀粉。此类酶除了有一个共同的(α/β)8-barrel式催化结构域外,在蛋白的C末端还有一个β链组成的淀粉结合结构域SBD(starch binding domain),此结构域为水解生淀粉所必需的特异性结构域。淀粉是碳水化合物中的一种,因此SBD属于碳水化合物结合模块CBM(carbohydrate binding module)。所有的碳水化合物结合模块可被分为多个CBM家族,在基于序列同源性的分类中,SBD被归为7大类的CBM家族：CBM20、CBM21、CBM25、CBM26、CBM34、 CBM41、CBM45。其中CBM20家族包含微生物α-淀粉酶的C末端SBD,是已知研究最为清楚的SBD。一些SBD的三维结构已经通过x-射线晶体学或核磁共振波谱学方法得到了解析。同全长α-淀粉酶的结构特点类似,虽然SBD的氨基酸序列有些差异很大,但其三维结构很保守,都是β折叠片堆叠形成的β-barrel式结构,构成活性位点的几个芳香族氨基酸也都相对保守。为揭示AmyP蛋白的功能机制特别是其降解生淀粉颗粒的特性,我们对其推定的C末端SBD结构域的结构与功能进行了初步的研究。在本课题中,我们重组表达和纯化了AmyP-SBD,并用圆二色谱(CD)、等温滴定微量热(ITC)和核磁共振(NMR)等技术对AmyP-SBD的结构与功能进行了初步的研究。CD和NMR实验结果显示Amy-SBD是一个类溶球态。等温滴定微量热和核磁共振实验则证实了AmyP-SBD与底物类似物p-环糊精的相互作用。值得注意的是,NMR化学位移扰动实验揭示：AmyP-SBD在结合p-环糊精前后经历了从无序向有序的构象转变。AmyP-SBD的这一“结合偶联折叠”性质在其它SBD上很罕见,对它的进一步考察对于我们深入理解AmyP蛋白的某些特性如优先降解生淀粉的机制及进一步的应用打下基础。

关键词： AmyP GH1337 x-射线晶体学淀粉结合结构域核磁共振结合偶联折叠