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B、C基因型乙型肝炎病毒x蛋白及其变异体的功能差别研究

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B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白及其变异体的功能差别研究

作者：徐晓福建医科大学

学位级别：硕士

目的通过研究B、C基因型乙型肝炎病毒x蛋白(hepatitis B virus x protein, HBx)及其变异体的功能差别,初步探讨导致B、C基因型乙型肝炎病毒相关性肝病/癌的不同临床及病理表现的机制。方法自GenBank中查找B、C基因型乙型肝炎病毒(hepati... 详细信息

目的通过研究B、C基因型乙型肝炎病毒x蛋白(hepatitis B virus x protein, HBx)及其变异体的功能差别,初步探讨导致B、C基因型乙型肝炎病毒相关性肝病/癌的不同临床及病理表现的机制。方法自GenBank中查找B、C基因型乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)株序列,选取其x基因片断并翻译成氨基酸序列后进行同源性比较,确定B、C基因型HBx各自的保守氨基酸序列,并寻找B、C基因型HBx的型特异性氨基酸差别。在此基础上构建保守的B、C基因型HBV x基因真核表达载体, 转染Chang细胞,研究其反式激活作用及抗细胞增殖能力的差异。自HCC患者血清中PCR扩增HBV全基因组DNA,测序并通过进化树分析对所获得的HBV DNA进行基因分型,并通过氨基酸同源比较观察HCC来源的B、C基因型HBx的变异情况,在此基础上,分别以保守的B、C基因型HBV x基因真核表达载体为模板构建相应的x基因突变体,转染Chang细胞,研究氨基酸变异对B、C基因型HBx反式激活作用及抗细胞增殖能力的影响。结果1. 对来源于GenBank的HBx的氨基酸序列进行比较,发现共有17个氨基酸具有明显的基因型特异性,分别位于第5、30、31、34、36、39、40、42、43、44、47、87、88、116、118、119、127位。其中,100%保守的B基因型特异性氨基酸位于34、39、40、42、88、119位,100%保守的C基因型特异性氨基酸位于34、39、43、47、88、118、119位。2. 构建了保守的B、C基因型HBV x基因真核表达载体,命名为BS、CS。转染Chang细胞后,发现B基因型HBx的反式激活能力强于C基因型HBx,而其抗Chang细胞增殖能力弱于C基因型HBx。3. 自HCC患者血清中PCR扩增HBV全基因DNA,克隆入pUC18载体,共获

关键词：乙型肝炎病毒 x蛋白基因型突变肝细胞肝癌反式激活抗细胞增殖作用

乙型肝炎病毒x基因多态性及x蛋白结合蛋白的初步研究

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乙型肝炎病毒X基因多态性及X蛋白结合蛋白的初步研究

作者：肖鸿敏福建医科大学

学位级别：硕士

目的:分子流行病学方法检测乙型肝炎病毒(HBV)病毒株x基因一种新的变异方式。利用酵母双杂交技术自健康人肝细胞cDNA文库中筛选HBV x蛋白结合蛋白基因,并以反向酵母双杂交方法验证候选结合蛋白。通过病毒蛋白-宿主蛋白作用探讨x蛋白在... 详细信息

目的:分子流行病学方法检测乙型肝炎病毒(HBV)病毒株x基因一种新的变异方式。利用酵母双杂交技术自健康人肝细胞cDNA文库中筛选HBV x蛋白结合蛋白基因,并以反向酵母双杂交方法验证候选结合蛋白。通过病毒蛋白-宿主蛋白作用探讨x蛋白在肝细胞内的可能存在的分子作用机制。方法:自HBV慢性感染患者血清中提取HBV DNA,扩增x基因序列,克隆入pMD19 T载体,选择阳性克隆进行DNA测序,与已知HBV基因相应序列比较该患者体内HBV基因变异位点以及变异形式。选择克隆x基因序列作为研究靶基因,定向克隆到pDEST32构建表达x基因诱饵质粒,命名为pDEST32—x,western blot法验证pDEST32—x的表达。酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库,选择阳性克隆质粒DNA测序,进行生物信息学技术分析。根据正向酵母双杂交的结果,PCR法扩增TCP1基因构建成诱饵质粒,将x基因构建成猎物质粒,反向酵母双杂交法验证正向筛选候选结合蛋白。结果:自21例患者中共挑选74个克隆测序,测序结果提示54个克隆x基因下游大段缺失突变,长度达234nt,位于1601-1834nt处,另有1个克隆发生245nt缺失突变。成功克隆了HBV x基因,构建了pDEST32-x酵母表达质粒及pDEST22-肝细胞cDNA文库。酵母双杂交筛选获得18个阳性克隆,其中3个克隆测序成功,均为TCP1蛋白基因。反向双杂交进一步验证了TCP1与HBV x蛋白的相互作用。结论:观察到一种x蛋白变异方式,这种大段缺失突变导致x蛋白下游编码序列丢失。成功筛选并克隆出肝细胞中HBV x蛋白相互作用蛋白——TCP1蛋白基因,有利于进一步研究HBV x蛋白在肝癌发生发展中的作用机制。

关键词：乙型肝炎病毒 x蛋白酵母双杂交蛋白-蛋白相互作用

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乙型肝炎病毒x蛋白和肝细胞癌

中华实验和临床病毒学杂志 1995年第4期9卷 388-392页

作者：方志正黄仕和卫生部武汉生物制品研究所

乙型肝炎病毒Ｘ蛋白和肝细胞癌方志正，黄仕和ＣｌａｕｓＨ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ只有几种病毒与自然宿主的癌症有关，这些病毒分为４个家族：含ＲＮＡ的逆转录病毒，疱疹病毒，乳头瘤病毒和含ＤＮＡ的肝炎病毒。在后３个家族里，肝炎病毒... 详细信息

乙型肝炎病毒Ｘ蛋白和肝细胞癌方志正，黄仕和ＣｌａｕｓＨ．Ｓｃｈｒｏｄｅｒ只有几种病毒与自然宿主的癌症有关，这些病毒分为４个家族：含ＲＮＡ的逆转录病毒，疱疹病毒，乳头瘤病毒和含ＤＮＡ的肝炎病毒。在后３个家族里，肝炎病毒致癌性最强［１］。已经确定了乙型肝...

关键词：乙型肝炎病毒 x蛋白肝细胞癌

肝癌组织中livin基因表达及与乙型肝炎病毒x蛋白的关系研究

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中华普通外科杂志 2008年第12期23卷 921-923页

作者：杨盛力陈孝平张万广刘利平梁慧芳任利张金良华中科技大学同济医学院附属同济医院肝脏外科中心武汉430030

目的探讨livin基因在肝癌组织中的表达及乙型肝炎病毒x蛋白（hepatitis Bvirus xprotein，HBx）对其表达的影响。方法采用免疫组化染色法检测10例正常肝组织和30例肝癌组织中livin基因的表达。建立稳定转染HBx基因的L02（L02-x）细胞系... 详细信息

目的探讨livin基因在肝癌组织中的表达及乙型肝炎病毒x蛋白（hepatitis Bvirus xprotein，HBx）对其表达的影响。方法采用免疫组化染色法检测10例正常肝组织和30例肝癌组织中livin基因的表达。建立稳定转染HBx基因的L02（L02-x）细胞系，采用Real—time PCR和Western blot检测E02-x）细胞系转染HBx基因前后livin基因表达的变化。结果Livin基因在肝癌组织的表达明显高于正常肝组织，且livin基因的表达与肝癌的大小、病理分级无明显相关性（t=1．688，P=0．103；γ=-0．137，P=0．471；P〉0．05），与门静脉癌栓有关（t=2．24，P=0．033；P〈0．05）。转染HBx基因后livin基因mRNA表达水平上调（t=6．73，P〈0．05）。结论livin基因高表达引起的凋亡抑制可能在肝癌的发生、发展中起重要作用，HBx基因可以在转录水平上调其表达。

关键词：癌肝细胞基因表达肝炎病毒乙型 Livin x蛋白

乙型肝炎病毒x蛋白诱导肝卵圆细胞恶性转化的研究

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乙型肝炎病毒X蛋白诱导肝卵圆细胞恶性转化的研究

作者：廖凯第三军医大学

学位级别：硕士

背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)越来越常见，据报道其发病率居恶性肿瘤发病率的前五，而其致死人数居每年恶性肿瘤致死人数的前三。我国是肝细胞癌(以下简称肝癌)的高发地区，而慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV... 详细信息

背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)越来越常见，据报道其发病率居恶性肿瘤发病率的前五，而其致死人数居每年恶性肿瘤致死人数的前三。我国是肝细胞癌(以下简称肝癌)的高发地区，而慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染经流行病学研究证实是我国原发性肝癌的第一大致病因素。慢性乙型肝炎病毒感染进展为肝硬化，最终进展为肝癌是HBV相关原发性肝癌发生发展的常规过程，但其中的机制研究仍未取得突破性进展。而由HBV x基因编码的乙型肝炎病毒x蛋白(Hepatitis B virus xprotein, HBx)被认为密切地参与了这一过程。HBx是由HBV x基因编码的多功能蛋白，广泛参与多种基因转录调控、细胞增殖转化、细胞信号转导等一系列过程。就目前而言，肝癌的具体发病机制仍未完全明了。普遍来说，肝癌的发生是一个多因素影响、多机制参与的过程。这些复杂的因素及机制被传统肿瘤发生理论归纳为正常肝细胞在各种致癌因素下，正常的生理机制被破坏，发生异常的转化导致肝癌的发生。而近些年来新提出的肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)理论为肝癌的发生阐释了另一个角度的可能。简单而言，肿瘤干细胞理论认为肿瘤由肿瘤干细胞分化而来，而肿瘤干细胞则可能源于各种因素及机制作用下的正常的干细胞异常转化。肝卵圆细胞(hepatic oval cell, HOC)作为一种具有多方向分化潜在能力的肝内细胞，被公认为肝干细胞。一系列研究提示肝卵圆细胞(以下简称卵圆细胞)可能参与了原发性肝癌的发生，在肝癌发生发展中起着重要作用。目的研究HBx对肝卵圆细胞的转化作用，探讨HBx是否能诱导卵圆细胞向肝癌细胞转化。方法 1构建表达HBx和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒载体LV-HBx-PM和对应的仅表达嘌呤霉素抗性基因的空慢病毒载体LV-PM。分别用构建好的慢病毒LV-HBx-PM和LV-PM感染WB-F344卵圆细胞。将感染慢病毒LV-HBx-PM的WB-F344卵圆细胞标记为WB-F344-HBx，设为实验组;将感染对照慢病毒LV-PM的WB-F344卵圆细胞标记为WB-F344-PM，设为阴性对照组;将未感染病毒并且培养相同代数的WB-F344卵圆细胞标记为WB-F344-Mock，设为空白对照组。经筛选培养，使用real-time RT-PCR和Western-blot分别在基因和蛋白水平检测HBx的表达。 2使用流式细胞术检测WB-F344-HBx、WB-F344-PM和WB-F344-Mock细胞的细胞周期。 3使用MTT法检测WB-F344-HBx、WB-F344-PM和WB-F344-Mock细胞的增殖能力。 4使用Transwell法检测WB-F344-HBx、WB-F344-PM和WB-F344-Mock细胞的迁移能力。 5分别将WB-F344-HBx、WB-F344-PM和WB-F344-Mock卵圆细胞接种于裸鼠左侧腋窝皮下，每组6只，接种6周后处死裸鼠，观察各组卵圆细胞成瘤的情况。 6采用HE染色的方法观察移植瘤组织情况，用免疫组织化学染色检测移植瘤组织中HBx和AFP的表达。结果 1WB-F344-HBx在基因水平和蛋白水平稳定高效表达HBx;WB-F344-PM和WB-F344-Mock不表达HBx。 2实验组WB-F344-HBx与阴性对照组WB-F344-PM相比，G0/G1期细胞比例降低[(55.98±0.39)%vs.(63.73±2.02)%，Px与阴性对照组WB-F344-PM相比，细胞增殖能力增强(Px细胞均具有细胞迁移能力，透膜细胞数分别为249.60±17.28个/视野、42.50±14.34个/视野和35.30±10.00个/视野。实验组WB-F344-HBx与阴性对照组WB-F344-PM相比细胞迁移数目明显增多(P<0.01)，而阴性对照组WB-F344-PM与空白对照组WB-F344-Mock相比细胞迁移数目无显著差异。 5接种后6周的饲养过程中，阴性对照组裸鼠死亡1只，其余两组裸鼠在饲养期内无死亡。实验组裸鼠成瘤(5/6例)，肿瘤直径7±1.9mm，阴性对照组裸鼠成瘤(0/5例)，空白对照组裸鼠成瘤(0/6例)。H

关键词：乙型肝炎病毒 x蛋白卵圆细胞恶性转化

乙型肝炎病毒x蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备和鉴定

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乙型肝炎病毒X蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备和鉴定

作者：刘湘重庆医科大学

学位级别：硕士

乙型肝炎是全球范围的严重公共卫生问题,全球感染HBV人数已经超过4亿,我国更是慢性乙型肝炎高发区。目前的研究表明,HBV诱导机体免疫反应,直接或间接地改变肝脏细胞的结构和功能,引发肝脏细胞的凋亡、坏死或癌变。其中,HBV x基因所编码... 详细信息

乙型肝炎是全球范围的严重公共卫生问题,全球感染HBV人数已经超过4亿,我国更是慢性乙型肝炎高发区。目前的研究表明,HBV诱导机体免疫反应,直接或间接地改变肝脏细胞的结构和功能,引发肝脏细胞的凋亡、坏死或癌变。其中,HBV x基因所编码的蛋白质HBx是一个重要的多功能调节因子,它通过调节转录活性、信号传导途径、基因毒性压力反应、蛋白质降解等方式,不仅影响HBV的复制和增殖,而且影响到宿主细胞的细胞周期调控、细胞凋亡以及细胞癌变。但HBx大部分作用的确切机制至今尚未阐明,许多研究结果互相矛盾,这可能与用于进行相关研究的抗HBx抗体的质量及转化的细胞系不同等因素有关。因此,制备高质量的抗HBx单克隆抗体可以给HBx功能机制的深入研究提供有力的工具,从而为HBV感染的防治及阻止HBV相关HCC的发生寻找新的思路。本课题的研究目的是通过构建和表达乙型肝炎病毒x基因原核表达载体,获得重组HBx蛋白,用纯化后的重组蛋白作为抗原制备鼠源单克隆抗体,并鉴定其特性。我们通过PCR扩增HBV基因组中x基因,将目的基因和pGEx4T-2载体经ECoRI与xhoI酶切、纯化、连接后,构建含有目的基因的重组质粒。将重组质粒转化*** BL21(DE3),并以IPTG进行诱导表达。表达产物经GST-Sepharose-4B琼脂糖树脂纯化后,用Western blot检测其抗原性。以重组蛋白GST-HBx免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗HBx的单克隆抗体(mAb),采用间接ELISA方法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA方法鉴定mAb的Ig亚类,检测mAb的效价及相对亲和力,并进行mAb结合表位分析。最后我们成功构建了重组表达质粒pGEx4T-2-HBx,经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为HBV x编码基因。经SDS-PAGE分析目的蛋白成功表达并获得纯化,Western blot检测显示目的蛋白具有良好的抗原性。通过杂交瘤技术获得两株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞AF5和DA12,其抗体亚类均为IgG1,腹水效价分别为1:106和1:108,相对亲和力AF5>105,DA12>106。ELISA相加实验结果显示两株mAb识别相同或相近的抗原表位。Western bolt检测证明我们获得的两株杂交瘤细胞所分泌的mAb特异性良好。综上所述,我们运用基因重组技术与原核表达方法获得了HBx融合蛋白,并成功对其进行了纯化,制备了抗HBx单克隆抗体。为我们进一步探讨HBx的生物学功能及其在HBV感染中的作用奠定了坚实的基础;为预防和治疗乙型肝炎,阻止HBV相关HCC的发生提供了新的思路。

关键词： HBV x蛋白单克隆抗体

乙型肝炎病毒x蛋白对肝癌细胞MKK3、p38MAPK表达的影响

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乙型肝炎病毒X蛋白对肝癌细胞MKK3、p38MAPK表达的影响

作者：蒲长宇第四军医大学

学位级别：硕士

背景:肝细胞癌(HCC)是一种常见的恶性肿瘤和全球范围内癌症的主要死亡原因之一。最近的流行病学数据表明,不仅在亚洲和非洲,而且在北美和欧洲,肝癌的发病率都呈现持续上升的趋势,而且在未来十年还将如此。HBV感染是肝癌的重要致病因素... 详细信息

背景:肝细胞癌(HCC)是一种常见的恶性肿瘤和全球范围内癌症的主要死亡原因之一。最近的流行病学数据表明,不仅在亚洲和非洲,而且在北美和欧洲,肝癌的发病率都呈现持续上升的趋势,而且在未来十年还将如此。HBV感染是肝癌的重要致病因素。尽管安全有效的HBV疫苗得到广泛应用,但慢性乙肝病毒(HBV)感染仍然是HCC最主要的致病因素,超过一半的HCC患者是HBV慢性携带者。亚洲和北美的研究显示,HBsAg携带者相对于非HBV感染人群,肝癌发生风险增加了25-37倍。肝癌预后一般不佳,而且确诊时往往都为晚期,给手术及局部治疗带来相当困难,而且肝癌对化疗具有相当的抵抗。HBV编码的x蛋白在HBV的致癌机制中扮演着重要的角色,在前期的相关研究中已被进一步证实,然而HBx对肝细胞癌变后的进一步发展是否有促进作用,以及相关的机制还不十分清楚,因此对HCC发生发展的分子机制的深入研究,有望寻找到更多的关键性分子,为临床靶向治疗提供理论依据。目的:观察乙型肝炎病毒x蛋白对肝癌细胞中丝裂原活化蛋白激酶激酶3(MKK3)及其下游分子p38丝裂酶原活化蛋白激酶(p38MAPK)的表达的影响,探讨相关的信号转导机制,及其对肝癌细胞生物学行为的影响。方法:分别将质粒pCDNA3.1及pCDNA3.1-HBx重组质粒经脂质体介导转染入人肝癌细胞株HepG2,经G418筛选培养,并用反转录PCR和Western blot鉴定,获得表达x蛋白的稳定细胞株HepG2-HBx和阴性对照细胞株HepG2-pCDNA3.1,同时以HepG2细胞株作空白对照。通过RT-PCR和Western blot检测上述三种细胞株中MKK3、p38MAPK在mRNA水平和蛋白水平的表达变化,并用细胞免疫荧光检查磷酸化p38MAPK蛋白在细胞浆及细胞核中的变化;通过MTT实验检测三种细胞株的增殖情况。采用SPSS12软件进行统计学分析。结果:MKK3在mRNA和总蛋白水平的表达在HepG2-HBx中均高于其他两组,其他两组无明显差异;p38MAPK在mRNA和总蛋白水平无明显差异,而其蛋白磷酸化水平和其在核蛋白中的表达在HepG2-HBx中较其他两组升高;细胞免疫荧光实验可见,HepG2-HBx细胞中,磷酸化的p38MAPK含量较其他两种细胞丰富,细胞核中的p38MAPK也明显多于其他两组细胞。在MTT实验显示,HepG2-HBx细胞较其他两组细胞有更强的增殖能力,尤其在转染72小时后更为明显。结论:HBx可以通过上调肝癌细胞中MKK3的表达,促进p38MAPK磷酸化和入核,从而进一步激活下游分子发挥生物活性。p38MAPK通路在HBx促进肝癌细胞的增殖中发挥重要作用。HBx的这一作用可能是导致HBV相关性肝癌与非HBV相关性肝癌临床特点及肿瘤生物学差异的机制之一。

关键词： x蛋白丝裂原活化蛋白激酶激酶3 p38丝裂酶原活化的蛋白激酶

乙型肝炎病毒x蛋白与hDaxx相互作用及对HepG2细胞凋亡的影响

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乙型肝炎病毒X蛋白与hDaxx相互作用及对HepG2细胞凋亡的影响

作者：李金丽南华大学

学位级别：硕士

目的:应用酵母双杂交法检测乙型肝炎病毒(HBV)x蛋白(HBx)与hDaxx的相互作用,并初步探讨其相互作用后对细胞凋亡的影响,为进一步研究HBx在HBV慢性感染致癌机制中的作用提供一定的实验依据。方法: (1)构建酵母菌真核表达载体pGADT7-HBx:... 详细信息

目的:应用酵母双杂交法检测乙型肝炎病毒(HBV)x蛋白(HBx)与hDaxx的相互作用,并初步探讨其相互作用后对细胞凋亡的影响,为进一步研究HBx在HBV慢性感染致癌机制中的作用提供一定的实验依据。方法: (1)构建酵母菌真核表达载体pGADT7-HBx:根据已知的HBV x基因序列,采用Primer Premier5.0软件设计一对引物,并分别引入EcoR I与xho I酶切位点,PCR扩增x基因;用EcoRI和xho I分别双酶切PCR产物和质粒pGADT7,分别纯化回收酶切产物,T4连接酶连接后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆。对重组质粒进行酶切及测序鉴定。 (2)构建酵母菌真核表达载体pGBKT7-hDaxx:用EcoRI和SalI分别双酶切质粒pGBDU-C1/hDaxx和pGBKT7,分别纯化回收酶切产物,T4连接酶连接后,转化大肠杆菌DH5α,筛选到阳性克隆后,对重组质粒行酶切鉴定。 (3)酵母双杂交检测HBx与hDaxx的相互作用:将酵母菌真核表达载体及酵母菌阴性阳性对照质粒分4组转化酵母菌AH109,A组为pGADT7和pGBKT7、B组为pGADT7-HBx和pGBKT7-hDaxx、C组为pGADT7-T和pGBKT7-Lam、D组为pGADT7-T和pGBKT7-p53,将转化菌落接种于SD/-Trp-Leu(二缺)固体平板,30℃培养2～4d。将单个菌落接种于SD/-Trp-Leu-His(三缺)和SD/-Trp-Leu-His-Ade(四缺)平板,30℃培养2～4d。裂解酵母菌,提取蛋白,经SDS-PAGE、Western blot检测hDaxx和HBx在酵母中的表达。 (4)流式细胞术检测细胞凋亡:将HBV x基因稳定转染入HepG2细胞(即HepG2x),再瞬时转染15μg、30μg和45μg pcDAN3.1-hDaxx,以pcDNA3.1(+)转染HepG2x组和HepG2x组分别作为对照。用10mmol/L的5-氟尿嘧啶(5-FU)处理36h后分别收集各组细胞,经75%的乙醇4℃固定过夜,PI染色后,用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。用统计软件SPSS13.0对实验数据进行LSD-t检验分析。结果: (1) PCR扩增HBV x基因片段(465bp),将x基因克隆至pGADT7载体上,经双酶切及测序分析,所克隆的目的片段与已知的x基因序列及GeneBank上公布的HBV x基因(Pubmed NC95551)序列完全一致。 (2)将pGBDU-C1/hDaxx上的hDaxx基因片段亚克隆至pGBKT7载体上,经双酶切分析,得约2.2kb大小的hDaxx基因片段,与预期值大小一致。 (3)分4组转化的酵母菌AH109在二缺陷平板上均可长出白色菌落,但仅有B、D两组菌可以在三缺和四缺平板上生长,选取B组四缺陷平板上单个菌落,提取酵母蛋白, Western blot检测到hDaxx和HBx在同一株酵母菌株中均有表达。 (4)将x基因稳定转染入HepG2细胞,Western blot检测到HBx在HepG2x细胞中的表达。经流式细胞术检测,HepG2细胞用5-FU处理后凋亡率明显高于未经5-FU处理的细胞组,结果具有显著性差异(Px组细胞凋亡率明显低于空细胞组,结果具有显著性差异(Pxx后,细胞凋亡率进一步降低,但与转染入的pcDAN3.1-hDaxx量没有剂量依赖关系。结论: (1)成功地构建了pGBKT7-hDaxx和pGADT7-HBx酵母菌真核表达载体,并可在酵母菌AH109中表达。 (2) HBx与hDaxx在酵母细胞内存在相互作用。 (3)构建了稳定表达HBx的细胞株HepG2x。 (4) HBx可抑制5-FU诱导的HepG2细胞凋亡,而hDaxx的高表达能提高HBx的抑制作用,使细胞凋亡率进一步降低。

关键词：乙型肝炎病毒 x蛋白 hDaxx 酵母双杂交凋亡

HBV x蛋白与细胞色素C氧化酶3相互作用位点的研究

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HBV X蛋白与细胞色素C氧化酶3相互作用位点的研究

作者：陈芸福建医科大学

学位级别：硕士

目的通过酵母双杂合体系研究乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)与细胞色素C氧化酶3(COxIII)相互作用的位点。方法用常规PCR和分子克隆技术构建HBV x变异体2种(x1编码HBV x蛋白1-72氨基酸,x2编码HBV x蛋白1-117氨基酸)到穿梭质粒pAS2-(1含GAL4 -BD)... 详细信息

目的通过酵母双杂合体系研究乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)与细胞色素C氧化酶3(COxIII)相互作用的位点。方法用常规PCR和分子克隆技术构建HBV x变异体2种(x1编码HBV x蛋白1-72氨基酸,x2编码HBV x蛋白1-117氨基酸)到穿梭质粒pAS2-(1含GAL4 -BD)上,通过醋酸锂方法转化入酵母AH109,以pAS2-1/x全长为对照;通过Western Blot的方法验证HBV x全长及变异体-BD融合蛋白在酵母细胞中的表达;经过滤膜转印法检测它们的自激活作用,将pAS2-1/x全长及变异体与pACT2/COxIII(pACT2含GAL4-AD)分别转化入酵母AH109及Y187中,进行酵母双杂交,在SC/-trp-leu检测转化效率,通过蓝白斑筛选检测β-半乳糖苷酶的活性从而得出HBx与COxIII的大致作用位点。结果pAS2-1/x变异体通过双酶切,PCR均检测出相应的片段,测序结果也符合预期。提取已转化入变异体的酵母AH109的DNA及蛋白,PCR和Western Blot验证pAS2-1/x全长及变异体-BD融合蛋白在酵母AH109中的成功表达。滤膜转印法排除了它们的自激活作用。经过与已转化有pACT2/COxIII的酵母Y187双杂交后,在SC/-trp-leu平板上有菌落生成,通过蓝白斑筛选,pAS2-1/ x1及pAS2-1/ x2均未使菌落变蓝。结论成功构建pAS2-1/ x变异体,并在酵母中成功表达。pAS2-1/ x变异体1和2均无自激活作用,并均不含与COxIII结合的位点,推测HBV x蛋白与COxIII的结合位点很可能位于HBx第118-154氨基酸。

关键词：乙型肝炎病毒 x蛋白细胞色素C氧化酶3 酵母双杂合体系