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乙型肝炎病毒x蛋白和环氧合酶-2与乙型肝炎相关肝癌微血管生成和转移的关系及其可能机制

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中华肝脏病杂志 2010年第11期18卷 831-836页

作者：刘凯歌邵小莉谢华红徐利赵慧郭战宏李莉刘杰西安医学院附属医院消化科 710077 第四军医大学西京医院肿瘤生物学国家重点实验室复旦大学华山医院消化科

目的探讨乙型肝炎病毒x蛋白（HBx）、环氧合酶-2（COx-2）在乙型肝炎相关性肝细胞肝癌（HCC）组织微血管生成和转移中的关系及其可能的调节机制. 方法选择84例乙型肝炎相关性肝细胞肝癌组织和22例非乙型肝炎相关性肝细胞肝癌组织,免疫... 详细信息

目的探讨乙型肝炎病毒x蛋白（HBx）、环氧合酶-2（COx-2）在乙型肝炎相关性肝细胞肝癌（HCC）组织微血管生成和转移中的关系及其可能的调节机制. 方法选择84例乙型肝炎相关性肝细胞肝癌组织和22例非乙型肝炎相关性肝细胞肝癌组织,免疫组织化学法检测HBx、COx-2及血管内皮细胞表面抗原（CD34）的表达,光镜下记录微血管计数（MVD）.Spearman相关性分析HBx、COx-2与乙型肝炎相关性HCC组织微血管生成及转移中的关系; Western blot和RT-PCR检测稳定转染HBx肝癌细胞HepG2（HepG2-x）中COx-2的变化;酶联免疫吸附法检测HepG2-x培养上清液中前列腺素E2（PGE2）表达水平及不同浓度（10、30、50 μ mol/L和70 μmol/L）COx-2选择性抑制剂塞来昔布作用后PGE2的表达水平;锥虫蓝拒染法检测细胞生长速度.结果乙型肝炎相关性HCC组织中HBx、COx-2均高表达,HBx阳性表达组中COx-2阳性率为88.87%（55/62）,明显高于HBx阴性组的31.82%（7/22,x2=27.188,P＜0.01）和非乙型肝炎相关性HCC组40.91%（9/22,x2=20.453,P＜0.01）;HBx阴性表达的乙型肝炎相关性HCC组和非乙型肝炎相关性HCC组中COx-2阳性表达率差异无统计学意义（x2=0.393,P=0.531）; HBx和COx-2在转移组表达高于无转移组（P＜0.01）;HBx及COx-2的阳性表达组平均MVD值均明显高于HBx阴性组和非乙型肝炎相关性HCC组（P＜0.05）,且转移组MVD高于无转移组（P＜0.01）;门静脉侵犯组高于非侵犯组（P＜0.01）;Spearman相关性分析结果提示HBx、COx-2在乙型肝炎相关性HCC组织微血管生成及转移中的表达呈正相关（Rs=0.568,P＜0.01）;在HepG2-x细胞中,COx-2蛋白及mRNA表达水平与转染空载体的对照肝癌细胞HepG2 （空载体转染HepG2细胞,HepG2-PC）相比,均显著提高,并且细胞培养上清液中PGE2表达水平也显著提高;和转染空载体的对照细胞相比,塞来昔布对转染HBx基因的细胞分泌PGE2具有更强的抑制作用.结论 HBx、COx-2在乙型肝炎相关性HCC中有较高的表达水平,二者呈正相关,与HCC微血管生成和侵袭转移密切相关.COx-2可能是HBx促使肝癌组织微血管生成和转移的一个重要中间分子,其可能的调节机制是通过HBx、COx-2及PGE2作为信号转导通路在HCC的浸润与迁移,在微血管生成与转移的过程中发挥双重作用.

关键词：癌肝细胞环氧合酶-2 肝炎病毒乙型 x蛋白肝炎病毒乙型微血管生成转移

乙型肝炎病毒x蛋白与细胞色素C氧化酶亚单位Ⅲ结合的定位研究

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中华肝脏病杂志 2014年第10期22卷 725-730页

作者：李丹陈治新陈芸林纳王小众福建医科大学附属协和医院消化科福州350001

目的探索细胞色素C氧化酶亚单位Ⅲ（COxⅢ）与乙型肝炎病毒x蛋白（HBx）的具体结合位点。方法构建pAS2-1-x变异体重组载体，醋酸锂转化法将其转入酵母细胞，通过PCR法及测序法证实目的片段转入酵母细胞；Westem blot法明确变异体蛋白在... 详细信息

目的探索细胞色素C氧化酶亚单位Ⅲ（COxⅢ）与乙型肝炎病毒x蛋白（HBx）的具体结合位点。方法构建pAS2-1-x变异体重组载体，醋酸锂转化法将其转入酵母细胞，通过PCR法及测序法证实目的片段转入酵母细胞；Westem blot法明确变异体蛋白在酵母细胞中能否正确表达，滤膜转印法排除自身激活作用；固体培养基交合实验及β-半乳糖苷酶活性实验检测HBx和COxⅢ的结合区域。结果成功构建含HBx第1～72位氨基酸的变异体重组载体pAS2-1-xl和第1～117位氨基酸的变异体重组载体pAS2-1-x2，测序及PCR均证实片段的正确性。Western blot证实变异体蛋白在酵母细胞中可正确表达，且变异体蛋白无自身激活作用。交合实验及β-半乳糖苷酶活性检测将HBx和COxⅢ的结合区域定位于72～117位氨基酸。结论通过酵母双杂合实验证实HBx和COxⅢ的结合区域定位于72～117位氨基酸，此结合区域的明确有望帮助进一步阐明x蛋白在体内的作用机制，并可能为慢性乙型肝炎、肝硬化及肝癌的防治提供新思路。

关键词：肝炎病毒乙型 x蛋白细胞色素C氧化酶亚单位Ⅲ 酵母双杂合结合位点

乙型肝炎病毒x蛋白羧基端氨基酸缺失对肝癌细胞生物学行为的影响

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中华医学杂志 2005年第12期85卷 825-830页

作者：刘晓红林静曹晓哲郑建明陈颖朱明华第二军医大学长海医院病理科上海200433 福建医科大学基础医学院组胚教研室

目的探讨乙肝病毒x蛋白(HBx)羧基端缺失了40个氨基酸的突变体(HBx3′-40)和野生型HBx对Huh7和SMMC-7721肝癌细胞的生物学行为的影响.方法脂质体和磷酸钙法介导pcDNA3HBx3′-40和pcDNA3HBx重组体转染HBV(-)的人肝癌细胞Huh7和***基因PCR... 详细信息

目的探讨乙肝病毒x蛋白(HBx)羧基端缺失了40个氨基酸的突变体(HBx3′-40)和野生型HBx对Huh7和SMMC-7721肝癌细胞的生物学行为的影响.方法脂质体和磷酸钙法介导pcDNA3HBx3′-40和pcDNA3HBx重组体转染HBV(-)的人肝癌细胞Huh7和***基因PCR及Western印迹方法检测质粒DNA片断插入和HBx蛋白质的表达.借助生长曲线、平板克隆形成、细胞周期、凋亡和裸鼠成瘤实验以及氯霉素乙酰转移酶(CAT)-ELISA法对转染细胞的生物学活性进行检测.结果 pcDNA3HBx3′-40组细胞生长速度明显快于pcDNA3HBx和pcDNA3组;pcDNA3HBx3′-40组克隆形成率明显高于pcDNA3HBx和pcDNA3组(Px3′-40表达能加速Huh7细胞由G0/G1期→S期的进程;但细胞凋亡检测显示无血清诱导的SMMC-7721细胞HBx3′-40组能部分取消HBx的促凋亡效应,并且该组几乎丧失了HBx的反式激活作用;裸鼠成瘤实验显示,pcDNA3HBx3′-40组成瘤体积明显大于pcDNA3HBx组和pcDNA3组,瘤体重量间差异具有统计学意义(Px3′-40对肝癌细胞的生长具有明显促增殖作用.结论 HBx碳端缺失了40个氨基酸的突变体转染细胞对比野生型HBx显示促增殖能力明显增强,推测HBx通过缺失突变修饰其生物学功能,取消了野生型HBx的反式激活功能和抗增殖效应.另一方面,HBx 114～154个氨基酸位点的缺失可能导致p53无法发挥其抑癌作用.

关键词：乙型肝炎病毒 x蛋白羧基端氨基酸肝癌细胞生物学行为

拉米夫定与原儿茶酸药物组合对HBV x蛋白入核的影响

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中国药学杂志 2010年第11期45卷 832-835页

作者：朱文婷陈勇吴建国韩凤梅湖北大学中药生物技术省重点实验室武汉430062 武汉大学国家病毒学重点实验室武汉430072

目的研究拉米夫定与原儿茶酸药物组合对乙肝病毒(HBV)x蛋白入核的影响。方法 Huh7细胞转染外源性GFP-HBx融合质粒后,与药物作用一定时间,利用共聚焦荧光显微镜观察药物对外源性HBV x蛋白在细胞内分布的影响。HepG2.2.15细胞与药物作用... 详细信息

目的研究拉米夫定与原儿茶酸药物组合对乙肝病毒(HBV)x蛋白入核的影响。方法 Huh7细胞转染外源性GFP-HBx融合质粒后,与药物作用一定时间,利用共聚焦荧光显微镜观察药物对外源性HBV x蛋白在细胞内分布的影响。HepG2.2.15细胞与药物作用一定时间后,用Western blot分析药物对内源性HBV x蛋白在细胞核内含量的影响。结果拉米夫定及其与原儿茶酸的药物组合对HBV x蛋白的入核有抑制作用,且联合用药效果最好。结论原儿茶酸能增强拉米夫定对HBV x蛋白入核的抑制,这是该药物组合抑制HBV复制的重要作用途径之一。

关键词：乙肝病毒 x蛋白拉米夫定原儿茶酸

HBV x蛋白调控miRNA致肝细胞癌发生机制的研究进展

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中华肝脏病杂志 2015年第6期23卷 477-480页

作者：郑盛杨涓杨晋辉云南省第三人民医院消化内科昆明650011 昆明医科大学第二附属医院肝病中心

肝细胞癌（HCC）是我国常见的恶性肿瘤之一.由于难以早期诊断和缺乏有效的治疗方法,HCC病死率非常高,其肿瘤相关致死率近年已经高居世界第二[1].肝细胞癌的发生和发展是多因素、多步骤的复杂过程,但是80％以上的HCC患者有HBV的感染史[2]... 详细信息

肝细胞癌（HCC）是我国常见的恶性肿瘤之一.由于难以早期诊断和缺乏有效的治疗方法,HCC病死率非常高,其肿瘤相关致死率近年已经高居世界第二[1].肝细胞癌的发生和发展是多因素、多步骤的复杂过程,但是80％以上的HCC患者有HBV的感染史[2],而在此过程中起重要作用的是HBVx蛋白（HBVx protein,HBx）.HBx是有HBV病毒基因组中x基因所编码的相对分子质量约为17 000的蛋白质,对基因转录、信号传递、细胞周期和细胞增生凋亡等均具有调节作用,因此在HBV诱发HCC过程中扮演重要角色[3-4].微小RNA （microRNA,miRNA）是一类新近发现的高度保守的非编码miRNA,参与转录后基因表达与调控[5-6].

关键词：癌,肝细胞细胞增殖细胞凋亡 HBV x蛋白

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x蛋白在乙型肝炎病毒生命周期中作用的研究

中华肝脏病杂志 2003年第8期11卷 511-512页

作者：宋家武林菊生华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所

x基因是一种仅存在于嗜肝乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)的基因,至今未在其它逆转录病毒和生物细胞中发现它.由于它的基因结构的特殊性及高度的保守性,提示其在HBV的生物学上具有重要的生物学意义,越来越多的证据表明,它是引起... 详细信息

x基因是一种仅存在于嗜肝乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)的基因,至今未在其它逆转录病毒和生物细胞中发现它.由于它的基因结构的特殊性及高度的保守性,提示其在HBV的生物学上具有重要的生物学意义,越来越多的证据表明,它是引起肝癌的直接病因,还广泛参与宿主细胞的基因表达、反式激活和细胞信号转导过程.

关键词： x蛋白乙型肝炎病毒生命周期作用研究

乙型肝炎病毒x蛋白对Polo样激酶1表达的调控作用

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中华肝脏病杂志 2016年第1期24卷 46-50页

作者：屠静张婷程锦曾浈浈鲁凤民陈香梅北京大学医学部基础医学院病原生物学系 100191

目的探索乙型肝炎病毒x蛋白（HBx）对Polo样激酶1（Plkl）的表达调控作用。方法pCMV-HA—HBx表达质粒瞬时或稳定转染HepG2细胞，Westernblot检测HBx对Plkl蛋白水平的影响；采用荧光素酶活性实验检测HBx对Plkl基因启动子活性的影响，实... 详细信息

目的探索乙型肝炎病毒x蛋白（HBx）对Polo样激酶1（Plkl）的表达调控作用。方法pCMV-HA—HBx表达质粒瞬时或稳定转染HepG2细胞，Westernblot检测HBx对Plkl蛋白水平的影响；采用荧光素酶活性实验检测HBx对Plkl基因启动子活性的影响，实时荧光定量PCR检测HBx对PlklmRNA水平的影响；采用Cycloheximide阻断新蛋白合成后检测HBx对Plkl蛋白半衰期的影响；流式细胞仪技术检测HBx对细胞周期的影响。组间数据比较采用t检验。结果Westernb10t结果显示，瞬时和稳定表达外源HBx蛋白都能显著上调S期HepG2细胞的Plkl蛋白相对水平（1．242±0．133与2．683±0．396，P〈0．05；1．340±0．128与3．683±0．349，P〈0．01）。荧光素酶活性和实时荧光定量PCR实验证实，HBx对Plkl基因的转录水平无影响，而Western1910t实验证实HBx能抑制S期P1R1蛋白的泛素化降解，使Plkl蛋白半衰期由30min延长至90min。与对照组相比，HBx过表达能促进S期和G：／M期细胞比例的增加（分别为31．65％与24．56％，9．43％与4．47％），G0／G1期细胞比例的减少（58．92％与70．97％）。结论HBx能通过抑制S期Plkl蛋白的降解进而上调Plkl蛋白的水平。

关键词：肝炎病毒乙型 x蛋白 Polo样激酶1 蛋白稳定性表达

乙肝病毒核心启动子部分缺失对其活性及x蛋白转式激活作用的影响

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中华微生物学和免疫学杂志 2002年第3期22卷 266-268页

作者：彭劼骆抗先郭亚兵侯金林陈金军第一军医大学南方医院感染内科广州510515

目的　研究乙型肝炎病毒 (HBV) 2 0 / 2 1bp缺失 (nt 174 8/ 174 7～nt 176 7)的核心启动子(CP)的活性及CP部分缺失对x蛋白转式激活作用的影响。方法　将HBVCPnt16 0 1～ 186 0区段克隆到氯霉素乙酰转移酶 (CAT)报告基因表达载体 (pCAT3... 详细信息

目的　研究乙型肝炎病毒 (HBV) 2 0 / 2 1bp缺失 (nt 174 8/ 174 7～nt 176 7)的核心启动子(CP)的活性及CP部分缺失对x蛋白转式激活作用的影响。方法　将HBVCPnt16 0 1～ 186 0区段克隆到氯霉素乙酰转移酶 (CAT)报告基因表达载体 (pCAT3 Basic)上 ,构建重组pCAT3质粒 (2 0d pCAT3、2 1d pCAT3、wt pCAT3)转染HepG2细胞以检测CP活性。将wt pCAT3与野毒株型或CP 2 0 / 2 1bp部分缺失的含 1.2拷贝HBV全基因重组质粒 (P3.8Ⅰ、2 0d P3.8Ⅰ、2 1d P3.8Ⅰ )共转染HepG2细胞以检测x蛋白的转式激活作用。ELISA方法检测CAT表达量。结果　PCR扩增和双酶切初步筛选的克隆株 ,经测序最终鉴定重组质粒克隆成功。重组pCAT3质粒转染HepG2细胞表明 ,CP缺失的重组表达载体 (2 0d pCAT3、2 1d pCAT3)较野毒株型CP的重组表达载体 (wt pCAT3)产生的CAT量明显下降 ,均仅为后者的14 .2 % ;共转染试验表明 ,wt pCAT3可被P3.8Ⅰ产生的完整x蛋白转式激活 ,而分别不能或仅能较弱地被共转染的 2 0d P3.8Ⅰ、2 1d P3.8Ⅰ产生的截短的x蛋白所改变。结论　HBV 2 0 / 2 1bp缺失的CP活性较野毒株型CP活性显著下降 ;CP2 0 / 2 1bp缺失株的x蛋白难以发挥转式激活作用。

关键词： x蛋白转式激活作用乙型肝炎病毒核心启动子缺失变异表达载体

肝细胞癌中雄激素受体与乙型肝炎病毒x蛋白表达的相关性及临床意义

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中华肿瘤杂志 2013年第4期35卷 282-287页

作者：顾栋桦朱亚珍王翔白直成平金良陈琦朱荣湖州市中心医院病理科 313000 中心实验室复旦大学上海医学院病理学系

目的探讨肝细胞癌（HCC）组织中雄激素受体（AR）与乙型肝炎病毒x蛋白（HBx）表达的相关性及其临床意义。方法荧光定量PCR检测AR和HBxmRNA的表达水平，Westernblot和免疫组化检测AR和HBx蛋白的表达情况，甲基化特异性聚合酶链反应检测A... 详细信息

目的探讨肝细胞癌（HCC）组织中雄激素受体（AR）与乙型肝炎病毒x蛋白（HBx）表达的相关性及其临床意义。方法荧光定量PCR检测AR和HBxmRNA的表达水平，Westernblot和免疫组化检测AR和HBx蛋白的表达情况，甲基化特异性聚合酶链反应检测AR启动子的甲基化状态。结果乙型肝炎病毒（HBV）相关HCC癌旁组织中ARmRNA的相对表达水平（0．17）高于癌组织（0．09，P〈0．01），而HBV阴性HCC癌旁组织中ARmRNA的相对表达水平（0．06）与癌组织（0．07）差异无统计学意义（P〉0．05）。HBV相关HCC癌和癌旁组织中ARmRNA的相对表达水平均高于HBV阴性HCC组（均P〈0．05）。HBV相关HCC癌旁组织AR蛋白的表达水平（0．35）高于癌组织（0．18，P〈0．05）。HBV阴性HCC癌和癌旁组织AR蛋白的表达水平分别为0．17和0．21，差异无统计学意义（P〉0．05）。HBV相关HCC癌旁组织中AR蛋白的表达水平均高于HBV阴性HCC组和肝血管瘤组（0．14，均P〈0．05）。HBV相关HCC癌组织中AR蛋白的表达水平与HBV阴性HCC癌组织差异无统计学意义（P〉0．05）。HBV相关HCC癌旁组织中ARmRNA的相对表达水平与HBxmRNA呈正相关（P〈0．01），AR蛋白的相对表达水平与HBx蛋白呈正相关（P〈0．01）；HBV相关HCC癌组织中ARmRNA的相对表达水平与HBxmRNA呈正相关（P〈0．01），AR蛋白的相对表达水平与HBx也呈正相关（P〈0．05）。AR启动子甲基化组与非甲基化组问AR和HBx的mRNA和蛋白的表达水平差异均无统计学意义（均P〉0．05）。在HBV相关HCC中，癌旁组织ARmRNA和蛋白的相对表达水平与肿瘤的分化程度呈负相关（均P〈0．05），AR表达越高，肿瘤分化程度越差；I盯癌组织ARmRNA和蛋白的相埘表达水平与肿瘤的分化程度无关。结论HBx可能通过促进基凶的转录增加HCC中AR的表达水平，但AR基因的甲基化状态的改变可能不是其主要的调节机制。AR表达水平的增加也许是HBV相关性HCC癌变过程中的早期事件。癌旁组织中AR的表达与肿瘤的分化程度有关，有助于判断HCC患者的预后。AR在HBV相关HCC与HBV阴性HCC中发挥的作用可能并不相同。

关键词：癌肝细胞受体雄激素肝炎病毒乙型 x蛋白预后