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wntless在乳腺非特殊类型浸润性导管癌组织中表达及其意义

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Wntless在乳腺非特殊类型浸润性导管癌组织中表达及其意义

作者：王建军南京大学

学位级别：硕士

目的：探讨乳腺非特殊类型浸润性导管癌(non-special type of invasive ductal carcinoma, IDC-NOS)组织wntless表达的临床病理特点。方法：收集10例正常乳腺组织标本、1995年1月至2015年7月44例原发性IDC-NOS及对应转移部位标本以及200... 详细信息

目的：探讨乳腺非特殊类型浸润性导管癌(non-special type of invasive ductal carcinoma, IDC-NOS)组织wntless表达的临床病理特点。方法：收集10例正常乳腺组织标本、1995年1月至2015年7月44例原发性IDC-NOS及对应转移部位标本以及2005年1月至2012年12月间本院179例IDC-NOS标本及获取其完整的临床资料,用免疫组化方法检测其ER、PR、Her-2、Ki-67、wntless的表达情况;其中56例使用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)检测Her-2扩增状态以及Oncomine数据库查询乳腺癌、正常乳腺及癌旁组织中wntless mRNA的表达;应用统计学软件回顾性分析包括年龄、月经状态、临床病理分期、组织学分级、淋巴结转移、复发、死亡情况及ER、PR、HER-2和Ki-67表达结果与wntless表达的关系。结果：组织学特征：IDC-NOS镜下可表现出高度的异质性：肿瘤细胞可排列成大小不等的巢状、条索状、小梁状或实性片状浸润性生长,可见间质显著促纤维反应,部分区域可见局灶性坏死;细胞形态上可出现不同程度轻微到明显的细胞多形性和核异性性。免疫组织化学结果：wntless在正常乳腺中腺腔上皮细胞呈阴性表达、肌上皮细胞胞质均呈恒定强阳性表达,wntless在乳腺IDC-NOS中肿瘤细胞胞质不同程度表达。179例IDC-NOS中wntless蛋白的总阳性表达率为58.7%。wntless在IDC-NOS中的表达较正常乳腺腺上皮表达明显升高(Pwntless与ER表达有关(Pwntless在44例原发性IDC-NOS及对应转移病例阳性表达率无关。综合分析179例IDC-NOS中有完整随访资料者以及44例浸润性导管癌中复发者原发部位中的未复发与复发时的wntless表达,差异具有统计学意义(Pwntless表达与ER (r=-0.162, P=0.030)呈负相关(相关性较弱),而与PR、Ki-67、Her-2表达、分子分型以及临床相关参数如年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、组织学分级、脉管侵犯、是否复发、淋巴结转移及临床病理分期相关分析差异均无统计学意义(P>0.05)。分子检查结果分析：179例中56例乳腺IDC-NOS进行了荧光原位杂交检测,Her/neu扩增结果阳性23例。χ2检验及Spearman等级相关性分析均提示Her-2 FISH扩增结果与wntless表达结果无统计学意义(P>0.05)。Oncomine数据挖掘分析：wntless mRNA乳腺浸润性导管癌癌组织中的表达低于正常及癌旁组织,在乳腺导管原位癌、浸润性小叶癌、髓样癌、粘液性癌和乳腺混合性导管-小叶癌癌组织中的表达也明显低于正常,并且都具有统计学意义(Pwntless mRNA较乳腺浸润性小叶癌以及混合性导管-小叶癌明显降低(Pwntless的表达明显降低(Pwntless低表达者术后无病生存时间短于wntless高表达者(差异接近有统计学意义,P=0.085)以及wntless低表达者总生存时间明显降低(Pwntless均与乳腺癌患者无病生存率有关(Pwntless均与乳腺癌患者总生存率有关pwntless均是影响乳腺癌患者DFS的独立预后影响因素(Pwntless均是影响乳腺癌患者OS的独立预后影响因素(Pwntless蛋白在IDC-NOS组织中的表达高于正常乳腺组织腺上皮,表明其在IDC-NOS恶性转化中及发生发展中起到一定作用,但具体的作用机制仍然需要进一步研究。(2) wntless在IDC-NOS中与ER呈负相关,而与PR、Her-2，Ki-67和其他临床相关参数意义不显著。(3) wntless表达与IDC-NOS的预后密切有关,高表达预示着IDC-NOS患者存在较低的复发

关键词： wntless 浸润性导管癌乳腺 ER PR Her-2 分子分型

小菜蛾眼色相关ABC转运蛋白基因和wntless的敲除及其效应

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小菜蛾眼色相关ABC转运蛋白基因和Wntless的敲除及其效应

作者：孟钱福建农林大学

学位级别：硕士

小菜蛾Plutella xylostella(L.)是重要的世界性迁飞农业害虫,主要为害十字花科作物。转基因技术的遗传调控在果蝇和蚊子的初步实现,为小菜蛾的防控提供了新思路。然而,在小菜蛾的转基因平台构建体系中仍缺乏一些便于筛选的遗传标记基因... 详细信息

小菜蛾Plutella xylostella(L.)是重要的世界性迁飞农业害虫,主要为害十字花科作物。转基因技术的遗传调控在果蝇和蚊子的初步实现,为小菜蛾的防控提供了新思路。然而,在小菜蛾的转基因平台构建体系中仍缺乏一些便于筛选的遗传标记基因。眼色相关的ABC转运蛋白基因属于ABC转运蛋白超家族,负责眼色素前体色氨酸和鸟嘌呤的转运。果蝇的眼色相关ABC转运蛋白基因突变之后产生易于观察的表型,可以作为筛选标记基因。因此,本实验以小菜蛾眼色相关的ABC转运蛋白基因为研究对象,利用CRISPR/Cas9技术,探究其突变之后在小菜蛾中引起的表型效应,为小菜蛾转基因平台提供遗传标记基因。另外,已有研究表明wntless对果蝇翅和体节的形成具有重要的作用,因此,开展小菜蛾翅发育相关基因wntless的研究,明确其对小菜蛾翅型和体节的影响。主要结果如下:经PCR检测验证,小菜蛾中存在3个眼色相关的ABC转运蛋白基因:Pxwhite、Pxscarlet和Pxok。三者不仅均具有ABC转运蛋白超家族的保守结构域,还在进化上高度保守。不同发育阶段的表达谱分析表明这3个基因在各个发育龄期均有表达,但表达丰度存在差异,其中最高表达量均在雄成虫中。不同组织表达模式分析表明Pxwhite在头、马氏管和精巢中的表达量最高,Pxscarlet在精巢中的表达量最高,Pxok在头部表达量最高;Pxwhite、Pxscarlet和Pxok在丝腺、中肠和卵巢中的表达量显著低于其它组织,几乎不表达。利用CRISPR/Cas9系统分别敲除小菜蛾Pxwhite、Pxscarlet和Pxok,并分别获得相应的纯合突变品系。基因型检测发现这些突变体的基因序列突变导致移码突变,翻译提前终止,不能形成完整的功能域。眼色表型观察发现Pxwhite突变体蛹后期和成虫期的眼色由原来的黑色或棕色变为白色;Pxscarlet突变体在蛹后期和成虫期的眼色表现为黄色;但Pxok突变体表型无明显可见的变化。眼黄素和蝶啶的含量测定结果表明,与野生型相比,Pxwhite和Pxscarlet突变体的眼黄素和蝶啶的含量均显著降低,Pxok突变体的眼黄素和蝶啶含量没有显著性差异。此外,对突变体的生物学参数测定发现,与野生型相比,Pxwhite突变体的幼虫发育历期显著增加,Pxscarlet突变体的蛹重显著降低;Pxscarlet和Pxok突变体的孵化率显著降低;这三个基因突变体对小菜蛾蛹发育历期和羽化率没有影响。Pxwhite和Pxscarlet敲除之后对小菜蛾的生长发育和繁殖的影响比较小,且具有可见的表型,有望作为标记基因用于转基因平台的构建及其他研究。利用CRISPR/Cas9技术成功实现Pxwntless定点突变,Pxwntless突变后蛹的翅和腹部发育异常,影响成虫的羽化和翅的发育。畸形个体靶点的基因型检测发现在靶点处存在不同片段的插入或缺失。Pxwntless突变的表型与基因型均可遗传给下一代。Pxwntless对小菜蛾的生长发育具有非常重要的作用,且可为明确小菜蛾Wnt通路奠定基础。本研究基于CRISPR/Cas9系统对小菜蛾眼色相关的ABC转运蛋白基因Pxwhite、Pxscarlet和Pxok,以及翅发育相关基因Pxwntless分别进行敲除,Pxwhite和Pxscarlet的敲除会导致小菜蛾眼色发生变化,证实Pxwhite和Pxscarlet参与小菜蛾眼色素的转运,且可作为筛选标记基因用于转基因小菜蛾的构建等科学研究中。Pxwntless突变个体影响小菜蛾翅的发育,可进一步研究分析其在小菜蛾Wnt信号通路中的功能作用。

关键词：小菜蛾 ABC转运蛋白 wntless CRISPR/Cas9 标记基因

wntless在乳腺非特殊类型浸润性导管癌组织中表达及其意义

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诊断学理论与实践 2016年第3期15卷 291-296页

作者：王建军程凯周晓蝶陈辉王璇王海石群立南京大学医学院临床学院/南京军区南京总医院病理科江苏南京210002

目的 :探讨乳腺非特殊类型浸润性导管癌(invasive ductal carcinoma,not otherwise specified,IDC-NOS)组织中wntless(WLS)的表达及其意义。方法:收集10例正常乳腺组织标本及2005年1月至2012年12月间本院179例IDC-NOS患者的肿瘤标本和完整的临床资料,采用免疫组织化学方法检测其组织标本中的雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)、人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor recepter 2,HER-2)、Ki-67及WLS表达,分析IDC-NOS患者的年龄、月经状态、临床分期、组织学分级、淋巴结转移、复发和死亡情况及ER、PR、HER-2、Ki-67表达结果与WLS表达的关系。结果:IDC-NOS组织中的WLS表达水平与正常乳腺中WLS表达差异有统计学意义(P0.05),生存分析提示WLS阴性者术后无病生存期有短于WLS阳性表达者的趋势(但差异无统计学意义,P=0.085),WLS阴性者总生存时间较WLS阳性表达明显降低(P<0.01);单因素及多因素Cox回归分析显示,WLS阳性表达是提示IDC-NOS患者预后较好的因素(P<0.01)。结论:WLS表达可能与IDC-NOS的发生、发展及预后有关,但目前其作用机制仍不明确,需进一步深入分析。

关键词： wntless 乳腺浸润性导管癌雌激素孕激素

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wntless在胃腺癌组织中表达及其意义

基础医学与临床 2017年第10期37卷 1440-1443页

作者：陈昌浩孙岳军徐洪明张建平南京医科大学第二附属医院普外科江苏南京210011 东南大学医学院附属江阴医院病理科江苏江阴214400

目的观察Wnt蛋白分泌相关的基因wntless在胃癌腺癌细胞和癌旁正常黏膜细胞的表达,分析wntless表达与胃腺癌病理指标之间相关性和临床意义。方法用免疫组化法检测胃腺癌组织和胃癌旁正常黏膜中wntless的蛋白表达。结果在104例胃癌标本中,... 详细信息

目的观察Wnt蛋白分泌相关的基因wntless在胃癌腺癌细胞和癌旁正常黏膜细胞的表达,分析wntless表达与胃腺癌病理指标之间相关性和临床意义。方法用免疫组化法检测胃腺癌组织和胃癌旁正常黏膜中wntless的蛋白表达。结果在104例胃癌标本中,wntless在胃腺癌组织中表达为:7.7%(8/104)例为0或1+、36.5%(38/104)例为2+、55.8%(58/104)例为3+;在癌旁正常黏膜表达为:71.2%(74/104)例为0或1+,19.2%(20/104)例为2+,9.6%(10/104)例为3+。wntless在胃腺癌组织中的表达显著高于胃癌旁正常黏膜表达(Pwntless蛋白表达与肿瘤分化呈正相关(Pwntless蛋白在胃腺癌中高表达,可能对肿瘤发生和进展等发挥了促进作用,并可能为新的靶向治疗提供分子靶标。

关键词： Wnt wntless 胃腺癌免疫组化

人树突状细胞中WNT蛋白分泌机制的初步研究

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人树突状细胞中WNT蛋白分泌机制的初步研究

作者：郭陈智华东师范大学

学位级别：硕士

树突状细胞(dendritic cells, DC)是体内最重要的抗原提呈细胞,而Wnt信号通路最近被证实在免疫系统中发挥多种调控作用,本论文是关于DC中Wnt信号通路的一些研究。本实验从外周血中分离获得单核细胞,体外加入细胞因子GM-CSF和IL-4诱导培... 详细信息

树突状细胞(dendritic cells, DC)是体内最重要的抗原提呈细胞,而Wnt信号通路最近被证实在免疫系统中发挥多种调控作用,本论文是关于DC中Wnt信号通路的一些研究。本实验从外周血中分离获得单核细胞,体外加入细胞因子GM-CSF和IL-4诱导培养5天后获得DC,然后以这种单核细胞来源的DC为研究对象,探讨DC中Wnt通路成员表达分泌及其对DC功能的影响。本实验首先通过RT-PCR的方法检测DC中Wnt通路成员的表达情况,结果显示,在单核细胞向DC的分化过程中始终表达WNT5A配体及Wnt通路多种受体Frz1、Frz2、Frz3、Frz4、LRP6以及ROR2的mRNA,免疫荧光的结果也证实WNT5A分布在DC的整个胞浆。DC中多种Wnt通路成员的表达提示我们Wnt信号通路可能对DC的分化或功能起重要的调控作用。SB216763可以作为经典Wnt通路(Wnt/β-catenin信号通路)的活化剂。本实验结果显示,体外加入10μM的SB216763处理2-3 h后,能引起DC中β-catenin的积累活化,而β-catenin信号活化后能引起DC表型的成熟,DC的共刺激分子CD80、CD86及与T细胞作用的功能分子CD40表达的平均荧光强度均明显增加,几乎达到成熟DC的水平。但是这种DC在功能上并未成熟,炎性因子IL-1β、IL-6、IL-12 p40、TNF-a及趋化因子受体CCR7的表达远低于LPS促成熟的DC,甚至低于对照组未成熟DC,因此属于一种耐受型的DC。另外,由于DC能分泌WNT蛋白,DC中WNT蛋白的分泌机制以及可溶性差的WNT蛋白在细胞间如何运输,这些都没有明确的结论。最近有研究证明,果蝇等模式生物发育过程中WNT蛋白的分泌需要wntless和Retromer Complex的协助。为证明DC中WNT5A的分泌是否也有wntless和Retromer Complex的参与,本实验利用RNAi的方法干扰wntless分子以及Retromer Complex的关键亚基Vps35的表达,免疫荧光结果显示,wntless和Vps35被干扰后DC细胞膜上WNT5A的分布明显减少。因此本实验证明,wntless和Retromer Complex参与DC中WNT蛋白的分泌过程。

关键词：树突状细胞 Wnt信号通路 WNT蛋白分泌 wntless Retromer复合物

日本血吸虫Wnt分泌相关蛋白的抑制研究及Wnt1的鉴定分析

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日本血吸虫Wnt分泌相关蛋白的抑制研究及Wnt1的鉴定分析

作者：塔娜中国农业科学院

学位级别：硕士

血吸虫(Schistosome)感染人及多种哺乳动物,具有重要公共卫生意义。Wnt信号通路是参与调控胚胎形态发育和生长,成体组织内环境的稳态等生物学过程的保守的信号通路。Wnt蛋白的分泌对Wnt信号通路的开启具有重要意义,本研究利用Wnt信号蛋... 详细信息

血吸虫(Schistosome)感染人及多种哺乳动物,具有重要公共卫生意义。Wnt信号通路是参与调控胚胎形态发育和生长,成体组织内环境的稳态等生物学过程的保守的信号通路。Wnt蛋白的分泌对Wnt信号通路的开启具有重要意义,本研究利用Wnt信号蛋白分泌抑制剂及RNA干扰Wnt信号蛋白分泌相关基因(Porcupine及wntless)来阻碍Wnt蛋白的分泌,探索Wnt信号通路转导的抑制对日本血吸虫生长发育及内环境稳态的影响;同时,对日本血吸虫Wnt1基因进行鉴定。1.日本血吸虫Wnt分泌相关蛋白的抑制研究选择以Porcn为靶点的Wnt信号蛋白分泌抑制剂C59给体外培养血吸虫添加及给感染血吸虫的小鼠口服,观察对体外培养和宿主体内生长虫体的Wnt信号通路的调节及产生的生物学效应。利用荧光定量PCR技术对Wnt信号通路成员基因mRNA水平进行比较,确定20 nmol/L为C59的最佳作用浓度;添加C59的第6天,体外培养的14天童虫的Wnt信号通路开始受到相对持续的抑制;添加C59的第7天体外培养的7天及14天童虫作用虫体的Wnt信号通路受到抑制程度最大;C59对14天童虫Wnt信号通路的抑制效果要比7天童虫更明显。荧光定量PCR分析,结果显示C59处理的7天童虫及14天童虫的促凋亡相关因子及DNA损伤相关因子的转录水平均有不同程度的上调,且14天虫体这些基因的转录水平上调的程度更大,推测是Wnt信号通路的抑制程度越大,细胞就更趋于凋亡。体外培养的14天虫体的扫描电镜结果显示:C59组虫体与DMSO组及空白对照组相比,体表结构没有明显差别,表明C59的添加未对虫体的体被屏障产生直接的刺激和损伤。透射电镜结果显示:C59组虫体超微结构模糊不清,肠腔上皮脱落,肠管微绒毛较少、断裂等变化,推测是由于Wnt信号通路的抑制导致内环境不能维持稳定,引起细胞凋亡甚至坏死,这与C59组凋亡相关基因表达上调的结果吻合。C59作用于体内寄生的日本血吸虫的研究结果显示,可引起虫体大部分Wnt信号通路成员转录水平下调,其中Wnt/β-catenin信号通路的成员基因及Wnt/Ca2+信号通路成员基因下调程度相对较大,推测童虫阶段Wnt/β-catenin信号通路及Wnt/Ca2+信号通路的调节功能活跃;C59可用于对宿主体内虫体Wnt信号通路的抑制实验。通过Race技术获得SjPorcn蛋白基因的全序列;其编码的氨基酸序列存在三个高度保守的氨基酸残基;利用RNA干扰SjPorcn,使其表达下调,也可引起类似C59对虫体Wnt信号通路产生的作用,导致Wnt/β-catenin、Wnt/PCP及Wnt/Ca2+信号通路不同程度的抑制。克隆鉴定了日本血吸虫的wntless基因(SjWls)。序列分析显示,SjWls氨基酸序列羧基末端为KEAFE并有一个保守的赖氨酸残基,该序列可能与SjWls的亚细胞定位相关。SjWls蛋白在虫体的组织定位分析,结果显示SjWls蛋白广泛分布于虫体吸盘、抱雌沟及生殖器官等组织中,表明Wls蛋白在各个组织中都有分布。利用RNA干扰SjWls,使其表达下调可以引起Wnt/β-catenin、Wnt/PCP及Wnt/Ca2+信号通路不同程度的抑制。2.日本血吸虫Wnt1基因鉴定及在不同发育阶段表达水平分析克隆鉴定了日本血吸虫的Wnt1基因(SjWnt1)。序列分析显示,SjWnt1蛋白有Wnt信号蛋白家族的结构功能域,但比高等生物的Wnt1少一个保守的Cys。mRNA和蛋白的定量分析结果显示,SjWnt1表达于血吸虫的整个发育过程,而在虫卵和早期童虫中呈高表达水平,提示SjWnt1对卵胚发育和早期童虫的细胞分化具有调节作用。来源于非适宜宿主及单性感染的发育不良虫体中SjWnt1 mRNA水平比发育正常的虫体高,表明不良发育的虫体相应的Wnt信号阻滞。SjWnt1表达下调后则引起Wnt/β-catenin、Wnt/PCP及Wnt/Ca2+通路的相应下游基因的mRNA水平下降,推测SjWnt1可能通过这3种传递途径行使信号传递的功能。本文开展了日本血吸虫Wnt分泌相关基因的抑制研究。确定了Porcn蛋白的专性抑制物C59的最佳作用浓度及时效,并分析了C59对体、内外童虫Wnt信号通路的抑制效果。筛选出两个Wnt蛋白分泌相关基因:Porcn及Wls的siRNA,并分析了Porcn及Wls基因下调对Wnt信号通路的抑制效果。为从整体上抑制血吸虫的Wnt家族蛋白,探讨该通路对血吸虫生长发育调控的分子机制建立了实验方法。另外,在前期研究工作的基础上,对SjWnt1进行了鉴定和分析,为认识SjWnt1在血吸虫发育中的调节功能提供实验基础。

关键词：日本血吸虫 Porcupine wntless Wnt1 C59

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Wnt蛋白分泌机制的研究进展

泰山医学院学报 2013年第11期34卷 884-886页

作者：李凤立靳卫国泰山医学院山东泰安271016 泰山医学院附属聊城医院山东聊城252000

人类疾病的发生发展是多因素、多环节共同参与的复杂过程,其中涉及多条复杂的信号转导通路.近年来,关于Wnt信号转导通路的研究越来越受到人们的重视.Wnt/β-catenin信号通路是人体内一条极为重要的信号转导途径,与胚胎发育密切相关,对... 详细信息

人类疾病的发生发展是多因素、多环节共同参与的复杂过程,其中涉及多条复杂的信号转导通路.近年来,关于Wnt信号转导通路的研究越来越受到人们的重视.Wnt/β-catenin信号通路是人体内一条极为重要的信号转导途径,与胚胎发育密切相关,对细胞的生长、增殖、分化及凋亡等生物学行为具有重要的调控作用.Wnt信号通路调节细胞生长、发育和分化的多个重要环节,在正常情况下对胚胎发育和成人的部分组织形成和功能发挥起着重要作用,而当该途径紊乱异常时,会导致多种疾病的发生.随着对该信号转导通路的研究逐渐深入,现比较明确的Wnt信号转导通路中的靶基因包括细胞增殖调控基因、发育控制基因和与肿瘤发生相关基因,如在细胞周期中能加速G1/S期进程的c-myc、cyclin D1及抗细胞凋亡的基因survivin 等.Wnt信号通路紊乱与众多人类肿瘤的发生密切相关,目前有十几种目前已知的高发性癌变都源于Wnt信号转导途径的失调[1-4].

关键词： Wntβ-catenin信号通路 Wnt蛋白 wntless Retromer复合体

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日本血吸虫分泌相关蛋白的抑制研究

日本血吸虫分泌相关蛋白的抑制研究