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wnt2b通过NF-κb/p65调节乳腺癌细胞的凋亡

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华中科技大学学报（医学版） 2012年第4期41卷 409-414,422页

作者：王鸿雁范良生黄浩周文娟宋欧诣马丁王常玉华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科武汉430030 湖北省老河口市人民医院妇产科老河口441800

目的研究wnt2b对乳腺癌细胞株MDA-Mb-231凋亡的影响,探讨其在乳腺癌发生发展过程中的重要作用。方法应用免疫组化技术检测40例乳腺癌组织标本中wnt2b的表达;应用Western blot检测乳腺癌配对细胞系MDA-Mb-231和MCF-7中wnt2b蛋白水平;通... 详细信息

目的研究wnt2b对乳腺癌细胞株MDA-Mb-231凋亡的影响,探讨其在乳腺癌发生发展过程中的重要作用。方法应用免疫组化技术检测40例乳腺癌组织标本中wnt2b的表达;应用Western blot检测乳腺癌配对细胞系MDA-Mb-231和MCF-7中wnt2b蛋白水平;通过瞬时转染wnt2b特异的siRNA沉默高表达wnt2b的MDA-Mb-231细胞系后,采用流式细胞仪检测转染前后细胞的凋亡水平;应用Western blot、共聚焦显微镜和凝胶电泳迁移实验(EM-SA)检测下调wnt2b表达后对NF-κb/p65的表达和活性的影响。结果相对于wnt2b阴性表达的正常乳腺组织,35例乳腺癌组织的表达呈强阳性并且存在核浆转移现象;在高转移细胞系MDA-Mb-231中wnt2b表达明显高于低转移细胞系MCF-7;针对wnt2b的siRNA沉默成功下调MDA-Mb-231中wnt2b表达后,细胞凋亡率明显增加并伴随NF-κb/p65的表达下降和活性降低;应用NF-κb/p65特异性的抑制剂PDTC阻断此通路后,wnt2bsiRNA诱导细胞的凋亡效应被阻断。结论 wnt2bsiRNA通过NF-κb/p65通路抑制乳腺癌细胞系MDA-Mb-231的凋亡而产生抗瘤作用,wnt2b可能成为乳腺癌有效治疗靶点之一。

关键词： wnt2b NF-κb p65 乳腺癌细胞凋亡

miRNA-324-3p及其靶基因wnt2b在鼻咽癌组织中的表达及临床意义

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临床耳鼻咽喉头颈外科杂志 2014年第21期28卷 1676-1678,1684页

作者：刘超李果刘勇粟忠武任舒灵邓腾波田勇泉邱元正中南大学湘雅医院耳鼻咽喉头颈外科耳鼻咽喉重大疾病研究湖南省重点实验室长沙410008

目的:探讨miRNA-324-3p及其靶基因wnt2b在鼻咽癌组织中的表达和临床意义。方法:qRTPCR技术检测miRNA-324-3p、wnt2bmRNA的相对表达量,Western blot技术检测wnt2b蛋白在39例鼻咽癌组织及21例鼻咽非肿瘤上皮组织中的表达,分析其表达水平... 详细信息

目的:探讨miRNA-324-3p及其靶基因wnt2b在鼻咽癌组织中的表达和临床意义。方法:qRTPCR技术检测miRNA-324-3p、wnt2bmRNA的相对表达量,Western blot技术检测wnt2b蛋白在39例鼻咽癌组织及21例鼻咽非肿瘤上皮组织中的表达,分析其表达水平与鼻咽癌临床病理特征的关系。结果:在鼻咽癌组织中miRNA-324-3p的相对表达量显著下调(Pwnt2bmRNA和蛋白的相对表达量则显著上调(均P24-3p与wnt2bmRNA及蛋白的表达呈负相关,wnt2bmRNA与蛋白的表达呈正相关(均P24-3p、wnt2bmRNA及蛋白的表达均与鼻咽癌患者T分级、临床分期及淋巴结转移密切相关(均P0.05)。结论:鼻咽癌组织中miRNA-324-3p的表达下调,wnt2b的表达上调,两者可能存在相互关系,共同介导鼻咽癌的发生、发展。

关键词：鼻咽肿瘤 miRNA-324-3p wnt2b 基因

wnt2b对人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响

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中华实验外科杂志 2018年第8期35卷 1500-1503页

作者：杨昆周栓虎周蔚沈龙祥安徽医科大学第一附属医院骨科脊柱外科合肥230022 上海交通大学附属第六人民医院骨科 200233 Department of Orthopedic Surgery Brigham and Women' s Hospital Harvard Medical School Boston MA 02115 USA

目的观察wnt2b对人骨髓间充质干细胞（hbMSCs）向软骨细胞分化的影响。方法采用慢病毒载体在1例hbMSCs中过表达wnt2b基因，并将其进行成软骨细胞诱导分化，以实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测软骨细胞标志基因性别决定区Y框蛋... 详细信息

目的观察wnt2b对人骨髓间充质干细胞（hbMSCs）向软骨细胞分化的影响。方法采用慢病毒载体在1例hbMSCs中过表达wnt2b基因，并将其进行成软骨细胞诱导分化，以实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测软骨细胞标志基因性别决定区Y框蛋白9（Sox-9）和Collagen Ⅱ的表达变化，在光镜下计数软骨岛的数目，定量检测软骨细胞分泌硫酸化糖胺聚糖的染色强度和肥大软骨细胞数目。结果在hbMSCs成软骨诱导分化过程中，过表达wnt2b对Sox-9基因的表达无显著影响（P=0.564）、显著抑制Collagen Ⅱ基因的表达（P=0.009），显著减少软骨岛的数目[（78.833±8.796）个/孔比（32.333±4.844）个/孔，P=0.000]，显著减少软骨细胞分泌硫酸化糖胺聚糖的染色强度[（80.247±4.806）个/孔比（53.165±4.723）个/孔，P=0.000]，显著减少三维诱导培养形成的肥大软骨细胞数[（13.833±2.994）个/视野比（6.667±1.211）个/视野，P=0.000]。结论wnt2b可以抑制体外hbMSCs向软骨细胞的分化成熟。

关键词： wnt2b 骨髓间充质干细胞软骨细胞分化基因过表达

The role of a Golgi-specific protein PAQR3 in epithelial-mesenchymal transition mediated by wnt2b in gastric cancer

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The role of a Golgi-specific protein PAQR3 in epithelial-mes...

Promotion of epithelial-mesenchymal transformation by hepatocellular carcinoma-educated macrophages through wnt2b/β-catenin/c-Myc signaling and reprogramming glycolysis

2017年中国肿瘤标志物学术大会暨第十一届肿瘤标志物青年科学家论坛

作者： Zhi-Qiang Ling Xiang-Liu Chen Jiu-Li Wang Lan Lei Lian-Lian Hong Zhejiang Cancer Research Institute Zhejiang Province Cancer HospitalZhejiang Cancer Center

It remains elusive whether deregulated wnt2 b pathway is involved in EMT, an early event that occurs during metastasis of gastric cancers(GC). Here, we demonstrated that wnt2 b induced GC cells to undergo a transition from the epithelial to the spindle-like mesenchymal morphology. wnt2 b reduced Ecadherin expression and increased that of mesenchymal proteins. In search of a downstream mediator that may account for wnt2 b-induced EMT, we focused on transcription repressors of E-cadherin, TWIST, SLUG, and Snail and found that cancer cells express high levels of TWIST and that PAQR3 downexpression enhances TWIST expression. PAQR3 downexpression significantly increases TWIST transcripts and protein in wnt2 b-expressing lines. Forced expression of PAQR3 can lower the expression of TWIST expression in wnt2 b expression cells. TWIST expression is suppressed by PAQR3. CHIP assays and western blot further showed that PAQR3 can promote the degradation of TWIST protein by regulated the ubiquitin proteasome pathway(UPP). Together, we reported here that wnt2 b signaling pathways induce EMT in gastric cancer cells via TWIST gene expression by PAQR3 loss.

关键词： Gastric cancer PAQR3 wnt2b TWIST epithelial-mesenchymal transition(EMT)

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Promotion of epithelial-mesenchymal transformation by hepato...

第十四届全国免疫学学术大会

作者： Jian Zhang Yu Jiang Qiuju Han Huajun Zhao School of Pharmaceutical Sciences Shandong University

background:Tumour-associated macrophages(TAMs) in the tumour microenvironment(TME) can promote the progression of hepatocellular carcinoma(HCC).Some tumours can be suppressed by targeting wnt2 b in tumour ***,the role of wnt2 b in HCC is still *** particular,the role of wnt2 b-mediated signal activation in macrophage polarization in the HCC microenvironment,and the regulatory effect between wnt and glycolysis in TAMs has not been ***:The expression of wnt2 b in TAMs was detected by qPCR and ***2 b/β-catenin interference in HCC-TAMs was performed by lentivirus carrying to rgeted shRNA orTLR9 *** related to macrophage polarization and the changes of key glycolytic enzymes expression were detected by flow cytometry and *** was analysed by Seahorse *** assay,wound healing assay,western blotting were used to evaluate the promoting effect of different HCC-TAMs on the proliferation,migration and EMT of HCC in *** cells and different HCCTAMs were injected via subcutaneously into immunodeficient mice to assess the effects of CpG ODN,wnt2 b,or β-catenin on HCC-TAMs in tumour growth in ***:Polarization-promoting factors derived from HCC cells upregulated the expression of wnt2 b in macrophages,which promoted the polarization of TAMs to M2-like macrophages by activating wnt2 b/β-catenin/c-Myc ***,this process was associated with the activation of glycolysis in *** HCC TAMs could promote the development of EMT,proliferation,and migration of *** addition to silencing wnt2 b or β-catenin expression,TLR9 agonist CpG ODN downregulated the level of glycolysis and inhibited the M2 polarization of HCC-TAMs,reversing the tumour-promoting effects ofTAMs in vitro and ***:As a potential target for HCC therapy,wnt2 b may play an important regulatory role for the functions of TAMs in the ***,the TLR9 agonist CpG ODN might act as a wnt2 b signal

关键词： Tumour-associated macrophages Hepatocellular carcinoma Epithelial-mesenchymal transformation Tumour microenvironment Glycolysis wnt2b β-Catenin C-Myc

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wnt2b促进肝癌细胞干性的研究

Wnt2b促进肝癌细胞干性的研究

作者：沈文姝山东大学

学位级别：硕士

研究背景肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是五大常见癌症之一,每年影响了全世界约100万人。尽管在过去几十年中肝癌的诊断和治疗取得了巨大进步,但治疗效果仍不令人满意。越来越多的证据表明,肿瘤干细胞能够在化疗放疗等治疗... 详细信息

研究背景肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是五大常见癌症之一,每年影响了全世界约100万人。尽管在过去几十年中肝癌的诊断和治疗取得了巨大进步,但治疗效果仍不令人满意。越来越多的证据表明,肿瘤干细胞能够在化疗放疗等治疗手段中生存下来、无限繁殖并会分化为肿瘤细胞,与癌症患者疾病的复发、转移以及预后较差直接相关。也有许多证据表明了肝癌干细胞的存在,并且肝癌干细胞被认为是肝癌起始、转移、复发和化疗耐药的原因。维持肿瘤干细胞生长和自我更新能力的重要信号通路有JAK/STAT、Hedgehog、wnt、Notch和NF-κb等。有研究报道,wnt信号通路的失常与肝癌的发生发展有关,有40%-70%的HCC患者在早期能检测到β-catenin蛋白在细胞核的累积,这是wnt/β-catenin信号通路活化的标志之一。然而,有关wnt信号通路的研究大多是针对经典或非经典wnt信号通路中的分子,比如wnt3a、wnt5a等,对于还没被鉴定信号通路类型的分子wnt2b的研究较少。在之前的研究中,我们课题组发现wnt2b在纤维化肝脏中高表达,并且能够抑制肝星状细胞的活化,发挥抗纤维化作用。肝纤维化的严重程度与肝癌患病率相关,wnt2b发挥着抗纤维化作用,那么在肝癌中是否也发挥着一定的作用呢?因此,在本研究中我们通过分子生物学和细胞生物学等多种实验手段,利用体内外模型探究wnt2b对肝癌细胞干性的影响。研究目的1.观察wnt2b在肝癌细胞及肝癌组织中表达水平的变化;2.探究wnt2b对肝癌细胞肿瘤生物学特征的影响并探讨其相关机制。研究方法1.应用实时荧光定量PCR对人正常肝细胞及常见肝癌细胞系中wnt2b的表达情况进行检测;2.在二乙基亚硝胺联合四氯化碳(DEN/CCl4)诱导的小鼠肝癌模型中,利用实时荧光定量PCR检测肝癌组织中wnt2b及AFP的表达水平;3.应用实时荧光定量PCR及Western blot验证过表达及敲低wnt2b质粒的过表达及敲低效果;4.用过表达wnt2b的质粒转染Hepal-6细胞24 h后,利用实时荧光定量PCR检测细胞中炎症因子的mRNA水平;5.用过表达及敲低wnt2b的质粒转染Hepal-6细胞48 h后,将转染细胞以1000个细胞/每孔重新接入6孔板中,培养1-2周,观察细胞的克隆形成;6.用过表达及敲低wnt2b的质粒转染Hepal-6细胞48 h后,应用实时荧光定量PCR检测细胞中肝癌干细胞标志分子CD44、EpCAM、CD47、ICAM-1、CD133的mRNA水平,同时应用Western blot检测其中EpCAM的蛋白水平;7.用过表达及敲低wnt2b的质粒转染Hepal-6细胞48 h后,将转染细胞以5000个细胞/每孔重新接入超低粘附6孔板中,培养1-2周,观察细胞的肿瘤成球情况;8.用过表达及敲低wnt2b的质粒转染Hepal-6细胞48 h后,应用实时荧光定量PCR检测细胞中干细胞多能转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-myc、Nanog的mRNA水平,同时应用Western blot检测其中Sox2的蛋白水平;9.用敲低wnt2b的质粒转染Hepal-6细胞24 h后,利用实时荧光定量PCR检测细胞中药物转运蛋白MRP和MDP的mRNA表达水平;10.用敲低wnt2b的质粒转染Hepal-6细胞48 h后,将转染细胞以7000个细胞/每孔重新接入96孔板中,加入不同浓度的索拉菲尼(sorafenib)药液,2天后利用MTT法检测细胞的增殖能力;11.合成针对wnt2b的shRNA序列,退火,经与酶切慢病毒载体pLKO.1连接、转化及测序等步骤,构建敲低wnt2b的慢病毒载体;12.利用磷酸钙转染,将构建的敲低wnt2b的慢病毒载体转染到293T细胞中,应用实时荧光定量PCR检测其敲低效果;13.慢病毒包装鼠源敲低wnt2b载体,收集病毒上清,用其感染Hepal-6细胞,分别用107、106两个数量级的细胞进行皮下荷瘤,比较各数量级下小鼠的肿瘤发生率。研究结果***2b在肝癌细胞及肝癌组织中高表达与正常肝细胞系HL-7702相比,肝癌细胞系SMMC-7721、bEL-7402、Huh7中wnt2b的mRNA表达水平显著升高。在DEN/CCl4诱导的小鼠肝癌模型中,肝癌组织中的wnt2b的表达水平与肝癌标记物甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP)的表达水平是一致的。2.过表达及敲低wnt2b的质粒是有效的在肝癌细胞Hepal-6中,转染过表达或敲低wnt2b的质粒后,从mRNA和蛋白水平上检测了其效果,结果证明过表达wnt2b后,细胞中wnt2b的mRNA水平和蛋白水平是升高的;敲低wnt2b后,细胞中wnt2b的mRNA水平和蛋白水平是降

关键词：肝癌肝癌干细胞 wnt2b

wnt2b对肝细胞癌生物学功能的影响及相关机制探究

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Wnt2b对肝细胞癌生物学功能的影响及相关机制探究

作者：李思宇山东大学

学位级别：硕士

研究目的肝癌是病死率最高的恶性肿瘤之一,也是威胁人类健康的重大疾病,其发病率一直很高。在我国,肝癌的死亡率位列第二、发病率位列第四。对于肝癌的诊断,主要是对肿瘤标志物的检测和影像学检查。对于肝癌的治疗的方法有很多,例如手... 详细信息

研究目的肝癌是病死率最高的恶性肿瘤之一,也是威胁人类健康的重大疾病,其发病率一直很高。在我国,肝癌的死亡率位列第二、发病率位列第四。对于肝癌的诊断,主要是对肿瘤标志物的检测和影像学检查。对于肝癌的治疗的方法有很多,例如手术切除等。但是,尽管经过了有效的治疗,肝癌仍然有复发和转移的可能。因此,需要进一步阐明肝癌发生的分子机制,发现肝癌发生时有差异的分子和异常的信号通路,寻找有效治疗肝癌的新方法,为临床治疗提供新的方向。近年来的研究中有学者发现,在肝癌的发生发展过程中有异常活化的信号通路。值得我们重视的是,在肝癌发生发展过程中有wnt经典信号通路的活化现象。wnt信号通路是一条高度保守的信号通路,其在生物体的胚胎发育,组织修复与再生,调控生物体内与细胞生长、凋亡、自我更新和生存基因的表达发挥着重要的作用。根据所激活信号通路的不同,wnt信号通路若依赖于β-catenin分子发挥作用则为经典的信号通路;若不依赖,则为非经典通路。关于wnt与肝脏的研究主要集中于wnt信号通路在肝纤维化过程中发挥的作用。研究表明,当经典的wnt信号通路发生活化时可激活肝星状细胞而导致肝纤维化。但是,对于wnt信号通路与肝癌的研究比较少,且目前对于wnt家族分子的研究主要集中于wnt3a与wnt5a。在前期工作中我们发现,与正常肝组织相比,病变肝脏中wnt2b分子呈现高表达趋势,并且与疾病严重程度有一定相关性。在TLR4促进HCC发生、TLR2抑制HCC发生的前提下,我们发现TLR4激动剂刺激人肝癌细胞系(HepG2,H7702)和鼠肝癌细胞系(Hepa1-6)wnt2b表达上调,TLR2激动剂刺激则表达下调。这些结果提示我们,在肝癌的发生发展过程中,wnt2b可能起到关键的作用。根据上述的实验现象,本研究在体外实验中利用分子生物学手段,探讨了 wnt2b分子对肝癌细胞的肿瘤生物学特征的影响,并探讨相关机制;并通过体内实验证明,wnt2b促进小鼠肿瘤的生长,且抑制肿瘤组织中NK细胞的数量和比例。另外,本研究初步探讨了抑制wnt2b的表达辅助治疗肝癌的应用,为肝癌的治疗提供新的靶点和实验依据。研究方法1.以几种常见的人和鼠肝癌细胞系为模型,采用MTT法、细胞平板克隆实验检测TLR2激动剂Pam3CSK4和TLR4激动剂LPS对肝癌细胞增殖能力的影响。2.采用免疫荧光、免疫组化及western blot方法,检测TLR4对肝癌细胞系和肝癌组织中β-catenin的影响。3.以不同的TLR缺失小鼠为模型,采用半定量RT-PCR法检测wnts mRNA的基础表达水平。采用半定量RT-PCR法,检测TLR2和TLR4对人肝癌细胞HepG2所有wnts mRNA水平的影响。4.采用半定量RT-PCR法和western blot,检测TLR2和TLR4对人肝癌细胞HepG2、H7402和鼠肝癌细胞系Hepa1-6中wnt2b mRNA的影响。5.采用MTT法检测wnt2b对肝癌细胞增殖的影响。采用细胞集落形成方法和Real-time PCR探究wnt2b对肝癌细胞系干性的影响。采用PI单染、Annexin V/PI双染法分别检测wnt2b分子对肝癌细胞周期和凋亡的影响。6.采用western blot、定量PCR、MTT法检测wnt2b对肝癌细胞的作用是否通过活化wnt信号通路。7.动物实验采用皮下肿瘤组织荷瘤,细胞内转染质粒并瘤内注射的方法观察wnt2b对肿瘤的影响,并用流式检测肿瘤组织和肝脏中淋巴细胞亚群的变化。研究结果***2抑制肝癌细胞系的增殖,TLR4则促进肝癌细胞系的增殖。TLR2抑制肝癌细胞的干性,TLR4则促进肝癌细胞的干性。***4促进肝癌细胞系中β-catenin的表达及入核。与TLR4缺失小鼠的肝癌组织相比,WT小鼠肝癌组织中β-catenin表达上调,且入核β-catenin增多。3.不同TLR缺失小鼠的肝组织中,wnts的表达不同。TLR2激动剂刺激人肝癌细胞系HepG2,wnt2分子,wnt2b分子表达下调。在TLR4激动剂LPS刺激下,wnt5a分子表达下调,wnt2b分子表达上调。***2抑制肝癌细胞系中wnt2b的表达,TLR4促进肝癌细胞系中wnt2b的表达。***2b促进肝癌细胞系的增殖。wnt2b促进肝癌细胞的干性。wnt2b抑制肝癌细胞系的凋亡,促进抗凋亡基因bcl-2和Mcl-1的表达,但不影响肝癌细胞系的周期。***2b对肝癌的促进作用是通过活化wnt/β-catenin信号通路实现的;沉默β-catenin后,wnt2b则不能发挥促进肝癌的作用。***2b促进肿瘤的生长并通过抑制肿瘤组织中NK细胞的数量。结论及意义1本文首次发现TLR2分子和TLR4分子在肝癌过程中对wnt2b表达的影响,发现TL

关键词： HCC TLR4 TLR2 wnt2b

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wnt2b促进IbD肠黏膜损伤的机制研究

WNT2b促进IBD肠黏膜损伤的机制研究

作者：肖姝喆广州医科大学

学位级别：硕士

研究背景炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IbD)是一种慢性非特异性肠道炎性疾病,主要包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)、克罗恩病(Crohn's disease,CD)、未定型炎症性肠病(IbD unclassified,IbDU)三种类型。近年来,我国儿童IbD的患者数量逐渐增加,已成为临床上消化道常见疾病之一,其病因可能与遗传易感人群、环境、感染、免疫功能、精神心理、饮食过敏等相关。对于IbD的发病机制研究一直是消化系统疾病研究的热点与难点。目前的发病机制研究主要是围绕着免疫细胞展开。巨噬细胞是肠道免疫稳态的关键看门人,机体受外界抗原的刺激,激活了巨噬细胞启动免疫应答异常反应,分泌炎症因子促进肠道炎症的发生。而IbD炎症的浸润,肠上皮黏膜屏障功能缺失是其重要的病理改变特征之一。肠上皮黏膜屏障主要是通过肠上皮细胞和细胞间的连接构成。而紧密连接蛋白、粘附连接和桥粒共同组成了细胞连接。紧密连接蛋白主要是由ZO、occludin、claudin蛋白组成,起着直接限制细胞旁通透性的作用。而粘附连接中最重要的成分是E-cadherin蛋白,多项研究表明IbD患者炎症上皮中E-cadherin蛋白的表达下调。目前研究多数是通过检测紧密连接蛋白、粘附蛋白水平和跨膜电阻值来评估肠上皮黏膜屏障功能。研究目的本实验拟探讨高表达wnt2b成纤维细胞激活巨噬细胞产生炎症因子CXCL12,破坏肠黏膜屏障功能,导致肠黏膜损伤,进而通过wnt/β-catenin信号通路促进IbD发生的机制,从而为IbD的治疗寻找新的靶点。研究方法(1)对IbD进行单细胞测序及通路分析。(2)从IbD患者的结肠炎及正常部位采集标本,用HE染色和组织病理学评分评估炎症,采用组织免疫荧光法巨噬细胞标记物CD11b和CXCL12的共定位。(3)实验组DMEM培养基中添加wnt/β-catenin通路的激动剂SKL2001,对照组DMEM培养基,使用qPCR、ELISA检测CXCL12表达情况。(4)使用 Western blot 检测了 β-catenin、GSK3 β、P-GSK3 β 的表达水平。(5)通过体外细胞共培养及条件培养,构建成纤维细胞对Caco-2细胞的作用模型。实验组为加入20%成纤维细胞条件培养基或与wnt2b高表达成纤维细胞共培养,对照组为不含条件培养基或与野生型成纤维细胞共培养,通过跨膜电阻和荧光黄渗透率的测定,评估Caco-2细胞屏障通透性的变化。(6)与wnt2b高表达肠道成纤维细胞共培养后,使用免疫荧光法检测Caco-2细胞β-catenin入核情况。(7)使用Western blot法检测Z0-1、E-Cadherin等紧密连接蛋白表达情况。(8)采用DSS(葡聚糖硫酸钠)对C57小鼠进行类bD肠炎造模,实验组使用Salinomycin(5 mg/kg,腹腔注射),对照组为对应溶剂生理盐水,分别对小鼠进行处理,评价该抑制剂对肠炎的治疗作用。研究结果(1)巨噬细胞在IbD患者的结肠炎组织中富集。(2)巨噬细胞标记物CD11b和CXCL12具有共定位情况,巨噬细胞可分泌CXCL12。(3)SKL2001是wnt/β-catenin通路的激动剂,可促进结肠炎中巨噬细胞的浸润和CXCL12的分泌,从而加重肠道炎症。(4)当wnt2b过表达时,GSK3 β磷酸化增强,说明了 wnt/β-catenin通路的激活。(5)与对照组相比,过表达wnt2b基因可致成纤维细胞分泌wnt2b蛋白显著增加,并促进Caco-2细胞β-catenin入核(P值2细胞中敲低FZD4表达可逆转这一作用,β-catenin入核减少,紧密连接蛋白表达上调。(7)加入20%成纤维细胞条件培养基或与wnt2b高表达成纤维细胞共培养组,跨膜电阻和荧光黄渗透率值明显降低,说明Caco-2细胞屏障通透性增大。(8)与对照组相比,过表达wnt2b组,ZO-1、E-Cadherin等紧密连接蛋白水平表达增强。(9)构建小鼠类IbD肠炎模型,HE及炎症评分均提示小鼠肠道有明显炎症浸润。(10)Salinomycin可明显减轻对DSS小鼠肠道炎症,并使肠黏膜紧密连接蛋白表达增多。结论高表达wnt2b激活巨噬细胞促进CXCL12的表达和分泌,激活wnt/β-catenin信号通路,破坏肠黏膜屏障功能,从而可能导致IbD炎症的发生发展,为IbD的治疗寻找新的靶点具有重要的现实意义。

关键词： wnt2b CXCL12 wnt/β-catenin信号通路成纤维细胞巨噬细胞炎症性肠病

wnt2b通过非经典wnt信号通路促进人骨髓间充质干细胞成骨分化的机制研究

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Wnt2b通过非经典Wnt信号通路促进人骨髓间充质干细胞成骨分化的机...

作者：黄义生南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景wnt蛋白是一种分泌型糖蛋白,分子量约为40 kDa,参与多种生物学现象的细胞因子,可激活经典/非经典wnt信号通路。非经典wnt信号通路中对骨组织产生的作用十分深远,它能与多条重要的人体信号通路相互交联,共同调控骨的生成、平衡... 详细信息

研究背景wnt蛋白是一种分泌型糖蛋白,分子量约为40 kDa,参与多种生物学现象的细胞因子,可激活经典/非经典wnt信号通路。非经典wnt信号通路中对骨组织产生的作用十分深远,它能与多条重要的人体信号通路相互交联,共同调控骨的生成、平衡和吸收。如:环磷腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)通路、c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路和Hippo通路等。然而作为wnt蛋白家族的一员,wnt2b蛋白一直以来发挥着上皮间充质转化、个体发育、肿瘤的增殖和迁移侵袭等重要作用,关于其在成骨方面的具体通路尚未报道。课题组前期研究中发现,wnt2b可以调控人骨髓间充质干细胞(hbMSCs)成骨分化,但是关于wnt2b如何调节hbMSCs具体机制通路尚不清楚。因此,本课题进一步探讨wnt2b调控hbMSCs成骨分化作用及机制通路。方法通过高通量测序hbMSCs成骨分化后mRNA差异表达谱进行分析,结果显示wnt2b及相关成骨标记基因RUNX2、bMP4和Sp7表达水平显著上调,并通过功能获得实验、qRT-PCR和Western blot验证wnt2b与成骨分化之间的关系。随后对高通量测序得到的差异基因进行GO和KEGG富集分析,并通过功能缺失实验、免疫荧光和染色实验,确定Hippo-YAP/TAZ通路和FZD5受体参与其中。最终通过功能缺失实验,以确定wnt2b促进hbMSCs成骨分化的具体调控网络。结果将成骨诱导分化前后的hbMSCs进行高通量测序分析,发现成骨诱导后wnt2b和成骨相关标记基因RUNX2、bMP4和Sp7均表达上调,并通过功能获得实验证明wnt2b与RUNX2、bMP4、Sp7之间存在正相关关系。将差异基因进行GO和KEGG富集分析,筛选相关分子功能和信号通路,发现差异基因主要富集的与成骨分化相关的有Hippo-YAP/TAZ通路。Western blot和qRT-PCR结果确认Hippo-YAP/TAZ通路参与其中。为了进一步确定wnt2b与Hippo通路之间的串联关系,通过构建si-YAP/TAZ细胞,进行功能缺失实验,发现wnt2b和YAP/TAZ之间存在正相关关系,并影响成骨标记基因的表达。为确定细胞表面受体,通过功能缺失实验,确定了 wnt2b配体通过FZD5受体激活YAP/TAZ的非经典wnt信号通路。进一步通过功能缺失实验,确定该通路上下游具体信号因子,发现wnt2b-FZD5-Gαq/11-Rho-Lats1通路激活YAP/TAZ。最后为确定YAP/TAZ入核后结合的转录因子,通过功能缺失实验,确定TEAD1为该通路的转录因子,调控RUNX2、bMP4、CTGF等成骨标记基因的表达。结论综上所述,本研究确定了 wnt2b-FZD5-Gαq/11-Rho-Lats1-YAP/TAZ-TEAD 1的信号通路,具体通路机制为:wnt2b通过FZD5受体,激活Gαq/11,Gαq/11激活Rho,Rho抑制Lats1功能,进而抑制Lats1对YAP/TAZ的磷酸化,使更多的YAP/TAZ入核与TEAD1结合,转录成骨相关基因(RUNX2、bMP4和CTGF),最终促进hbMSCs成骨分化。本课题拓宽非经典wnt信号通路调控网络,更为hbMSCs应用于骨组织工程,修复骨缺损提供新的理论基础。

关键词：骨髓间充质干细胞 wnt2b 非经典wnt信号通路 YAP/TAZ 成骨分化