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LncRNA-MEG3在氯化镍暴露诱导肺上皮细胞发生EMT和获得肿瘤干细胞样特征中的作用及机制研究

LncRNA-MEG3在氯化镍暴露诱导肺上皮细胞发生EMT和获得肿瘤干细胞...

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作者：李蕙君安徽医科大学

学位级别：硕士

研究背景:氯化镍（nickel chloride,NiCl）在自然环境和职业环境中分布广泛,并且长期职业接触可能会导致人体产生肺癌等恶性肿瘤。本课题组对短期和长期氯化镍暴露的人肺上皮细胞系BEAS-2B进行差异性LncRNA选择,研究结果表明,LncRNA-MEG... 详细信息

研究背景:氯化镍（nickel chloride,NiCl）在自然环境和职业环境中分布广泛,并且长期职业接触可能会导致人体产生肺癌等恶性肿瘤。本课题组对短期和长期氯化镍暴露的人肺上皮细胞系BEAS-2B进行差异性LncRNA选择,研究结果表明,LncRNA-MEG3表达水平发生下降,并且LncRNA-MEG3下调后可通过下调PHLPP1转录,增强HIF-1α蛋白翻译,促进人肺上皮细胞转化为恶性细胞。然而在镍化合物通过抑制LncRNA-MEG3表达促进人肺支气管上皮细胞转化为恶性细胞的过程中,LncRNA-MEG3是否在上皮间质转化（Epithelial mesenchymal transformation,EMT）和肿瘤干细胞（cancer stem cell,CSC）的形成过程中发挥作用目前尚不完全清楚。研究目的:体外实验培养人肺支气管上皮细胞系BEAS-2B,探讨LncRNA-MEG3在氯化镍暴露诱导人肺支气管上皮细胞发生上皮间质转化和获得肿瘤干细胞样特征中的作用,阐明氯化镍暴露诱导上皮间质转化和肺癌肿瘤干细胞的形成机制。研究方法:用生长状态良好的人肺支气管上皮细胞进行实验,分别进行以下操作:第一部分LncRNA-MEG3在氯化镍诱导人肺支气管上皮细胞获得肿瘤干细胞样特征中的作用及机制研究为研究LncRNA-MEG3在氯化镍暴露形成肿瘤干细胞过程中的作用,将人肺支气管上皮细胞用0.25 mM的氯化镍染毒6个月,然后采用自由悬浮成球实验分析细胞自我增殖能力;分别将人肺支气管上皮细胞用0.5 mM的氯化镍染毒0、1、3、6、12、24 h,将人肺支气管上皮细胞分别用0、0.125、0.25、0.5、1.0mM的氯化镍染毒24h,然后分别采用蛋白免疫印迹实验分析上述不同时间剂量染毒细胞内肿瘤干细胞特异性标志蛋白表达水平,同时采用半定量PCR实验分析LncRNA-MEG3表达水平。通过稳转外源性LncRNA-MEG3过表达质粒来增加人肺支气管上皮细胞中LncRNA-MEG3表达,然后用氯化镍处理人肺支气管上皮稳转细胞系6个月,采用自由悬浮成球实验分析细胞自我增殖能力,采用蛋白免疫印迹实验分析上述不同时间剂量染毒细胞内肿瘤干细胞特异性标志蛋白表达水平。为探讨LncRNA-MEG3在NiCl暴露后诱导肿瘤干细胞形成过程中的作用机制,采用蛋白免疫印迹实验分析人肺支气管上皮稳转细胞系经氯化镍暴露后细胞内wnt3a,wnt5a及WIF1蛋白表达水平,再采用q RT-PCR实验分析细胞内wnt3a,wnt5a及WIF1mRNA水平,用免疫荧光实验分析β-catenin进入胞核量的变化。第二部分LncRNA-MEG3在氯化镍诱导人肺支气管上皮细胞发生上皮间质转化中的作用及机制研究将人肺支气管上皮稳转细胞系在氯化镍环境中暴露处理24h,相差显微镜观察细胞形态变化,同时采用蛋白免疫印迹实验分析过表达LncRNA-MEG3后E-cadherin和Vimentin等上皮间质转化相关蛋白的表达水平,以及p-P42/44、P-p38、P-JNK、TGF-β、p-Smad3、p-Smad2等与上皮间质转化有关的蛋白表达水平改变。研究结果:1.氯化镍暴露下调LncRNA-MEG3表达水平,并呈时间剂量效应关系。与对照组相比,差异具有统计学意义（P抑制氯化镍暴露诱导的肿瘤干细胞样改变:过表达LncRNA-MEG3后,细胞自我增殖能力减弱:肿瘤干细胞特异性标志蛋白表达水平下调,差异具有统计学意义（P抑制氯化镍暴露后所诱导β-catenin蛋白进入胞核和上调wnt3a、wnt5a mRNA和蛋白表达水平:LncRNA-MEG3过表达,β-catenin蛋白进入胞核减少,wnt3a、wnt5a mRNA和蛋白表达水平下调。与对照组比较,差异具有统计学意义（P抑制氯化镍下调WIF1mRNA和蛋白表达水平:过表达LncRNA-MEG3后,WIF1 mRNA和蛋白表达水平上调。与对照组比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。5.氯化镍暴露诱导人肺支气管上皮细胞发生上皮间质转化:人肺支气管上皮细胞暴露于氯化镍后,形态发生了上皮间质转化样改变,并且上皮标记蛋白（E-cadherin）的表达水平下降,间充质标记蛋白（Vimentin）的表达水平上升;表明氯化镍暴露诱导人肺支气管上皮细胞发生上皮间质转化。***-MEG3调节氯化镍暴露诱导的上皮间质转化:人肺支气管上皮细胞中过表达LncRNA-MEG3后,氯化镍诱导的细胞上皮间质转化样形态改变、上皮标记蛋白（E-cadherin）蛋白表达下调、间充质标记蛋白（Vimentin）蛋

关键词：氯化镍 LncRNA-MEG3 肿瘤干细胞支气管上皮细胞 wnt抑制分子1 上皮间质转化

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