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光暗条件下拟南芥CESA2和CESA5对CESA6功能冗余的研究

光暗条件下拟南芥CESA2和CESA5对CESA6功能冗余的研究

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作者：陶章生华中农业大学

学位级别：硕士

拟南芥是重要模式植物,已发现10个纤维素合酶基因(AtCesA1～AtCesA10)。AtCESA1、AtCESA3、AtCESA6是初生壁纤维素合酶基因,AtCESA4、AtCESA7、AtCESA8是次生壁纤维素合酶基因,分别参与拟南芥不同生育期的纤维素合成;根据突变体的表型... 详细信息

拟南芥是重要模式植物,已发现10个纤维素合酶基因(AtCesA1～AtCesA10)。AtCESA1、AtCESA3、AtCESA6是初生壁纤维素合酶基因,AtCESA4、AtCESA7、AtCESA8是次生壁纤维素合酶基因,分别参与拟南芥不同生育期的纤维素合成;根据突变体的表型变化推测AtCESA2、AtCESA5、AtCESA9对AtCESA6可能存在部分功能冗余。但AtCESA2、AtCESA5对AtCESA6的冗余过程,AtCESA2、AtCESA5在纤维素合成中的作用等问题还不清楚。本实验根据拟南芥8个纤维素合酶基因(AtCesA1～AtCesA8)序列,在高变区Ⅰ处设计引物,合成了GST-AtCESAs融合蛋白,制备了抗体。以AtCesA6突变体为材料(prc1-1、cesa6),从基因水平、蛋白水平和细胞壁成分三方面研究了在光暗条件下AtCESA2和AtCESA5对AtCESA6的冗余功能,探讨AtCESA2、AtCES-A5在纤维素合成中的作用。主要结果如下：1.纤维素合酶抗体的制备和检测制备了AtCESA1～AtCESA8的多克隆抗体。western-blotting检测发现：AtCESA4和AtCESA7有严重的交叉反应,所以这两个抗体不能使用;其它抗体都能在拟南芥原生质膜上免疫出相应的特异条带。2.光暗处理下拟南芥下胚轴AtCesAs的表达分析GUS染色结果和Real-time PCR结果表明：AtCesA1、AtCesA3、AtCesA6暗处理下表达明显增加;AtCesA2暗处理下表达量较低,而暗转光后表达量明显增加;AtCesA5光暗处理下表达变化趋势不显著。3.光暗处理下拟南芥突变体纤维素合酶基因水平分析与野生型相比,突变体prc1-1、cesa6光暗处理下的AtCesAs的表达都显著降低;光暗比较发现：暗处理下prc1-1、cesa6的AtCesA1、AtCesA3、AtCesA5的表达明显高于光处理。4.光暗处理下拟南芥突变体纤维素合酶蛋白水平分析与野生型相比,光暗处理下prc1-1、cesa6原生质膜总蛋白中的AtCESA6显著降低,AtCESA5显著增加。光下AtCESA2在AtCESAs中所占的比例并没有明显的变化,而暗处理下AtCESA2在AtCESAs中所占比例显著降低。因此推测,AtCESA5在光暗9天的prc1-1、cesa6中都能替补AtCESA6的部分功能,维持突变体存活;AtCESA2只在光下9天的prc1-1、cesa6中弥补AtCESA6的部分功能,使植株能够正常生长。但是在突变体纤维素合酶复合体中AtCESA1、AtCESA3、AtCESA6、AtCESA2、AtCESA5的含量都降低了。与野生型相比,光下突变体prc1-1、cesa6的纤维素合成量显著增加,胼胝质合成量没有明显变化,cesa6的更为显著;而暗处理下纤维素、胼胝质合成量显著降低,prc1-1的更为明显。5.拟南芥突变体成分分析与野生型相比,光下9天,prc1-1的晶体纤维素显著下降,非晶体纤维素显著增加;cesa6的晶体纤维素含量降低了,非晶体纤维素、半纤维素、果胶质、可溶性糖都显著增加。暗处理9天,prc1-1的晶体纤维素显著下降,非晶体纤维素、半纤维素、果胶质、可溶性糖都显著增加;cesa6的晶体纤维素显著下降,非晶体纤维素没有明显变化,而半纤维素、果胶质、可溶性糖都显著增加。6. AtCesA6突变后对次生壁的影响与野生型相比,prc1-1、cesa6秸秆的果胶质显著增加,半纤维素、非晶体纤维素和晶体纤维素都显著降低,木质素变化不显著。prc1-1、cesa6秸秆纤维素的聚合度、结晶度没有明显的变化;半纤维素的支链有明显的增多;木质素单体的H显著增加,G、S显著降低。与野生型相比,cesa6的纤维素酶酶解产糖率最高增加(8.83±0.87)%,prcl-1增加(5.68±0.49)%;而IRX-3的增加了(36.63±2.67)%。

关键词：拟南芥抗体制备定量-PCR 初生壁纤维素合酶基因光暗处理 western-blotting Co-IP 活性分析成分分析

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NFAT1、Foxp3在再障患儿外周血单个核细胞中的表达及临床意义

NFAT1、Foxp3在再障患儿外周血单个核细胞中的表达及临床意义

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作者：曹祎明郑州大学

学位级别：硕士

再生障碍性贫血（aplastic anemia, AA）简称再障,是一组由化学、物理、生物、药物及不明因素引起的骨髓造血干/祖细胞与造血微环境损伤,导致骨髓造血功能衰竭及外周血全血细胞数量减少的一种疾病。由于病因及发病机制尚未完全明确,故... 详细信息

再生障碍性贫血（aplastic anemia, AA）简称再障,是一组由化学、物理、生物、药物及不明因素引起的骨髓造血干/祖细胞与造血微环境损伤,导致骨髓造血功能衰竭及外周血全血细胞数量减少的一种疾病。由于病因及发病机制尚未完全明确,故治疗较困难,是儿童常见的难治性血液病之一。再障发病机理较为复杂,以往学者多认为,造血干细胞损伤、造血微环境缺陷和免疫介导因素导致了再障的发生,此三种发病机制在不同的患者体内单独存在或联合作用,导致造血功能衰竭。目前越来越多的临床及实验室研究证实,免疫系统的紊乱包括T淋巴细胞数量和功能异常所造成的造血抑制,在AA的发生、发展中起着重要的作用。临床资料显示约70%左右再障患者应用免疫抑制剂如抗胸腺细胞球蛋白（ATG）/抗淋巴细胞球蛋白（ALG）及环孢菌素（CsA）治疗有效,提示了免疫功能异常因素介导的造血抑制在再障发病中的重要作用。近年来CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）引起国内外学者的广泛关注,它在维持外周免疫耐受中起着重要作用。临床研究发现,CD4+CD25+Treg细胞与多种自身免疫性疾病、移植排斥、肿瘤及病毒感染相关。国外有学者研究表明,CD4+CD25+T淋巴细胞被分为三个表型：CD25high+、CD25intermediate+和CD25low+。具有免疫抑制功能的Tregs高表达IL-2Rα（CD25）,另外也表达转录因子Foxp3,其表型显示为CD4+CD25high。最近国内学者在分析中国健康人外周血中CD4+CD25+Treg细胞表达频率时,采用三色免疫荧光染色分析技术分选了具有CD4+CD25int/highCD127low表达特征的细胞群。经胞内Foxp3染色的结果亦证实：CD25int/highCD127low表达的细胞Foxp3阳性,而CD25lowCD127high细胞几乎全部Foxp3表达阴性。由此提示CD25int/highCD127low可作为Treg细胞表面的特征性标志物而用于Treg的分选。转录因子Foxp3及活化的T细胞核因子（NFAT）在Treg的发育和分型中起重要的作用。有实验证实：Foxp3决定了调节性T细胞的抑制功能,且Foxp3可能通过翻译水平来改变调节性T细胞的抑制功能。活化T细胞核因子（NFAT）是T细胞受体（TCR）介导的信号转导通路中非常关键的转录因子。NFAT家族主要包括NFAT1、NFAT2、NFAT3和NFAT4四个成员。Solomou等发现：再生障碍性贫血患者外周血单个核细胞中Treg的表达降低,Foxp3在蛋白水平和mRNA水平也是显著降低的,同时伴随着NFAT1蛋白的降低,并且NFAT1蛋白的低表达可能可以解释Foxp3的低表达和Treg的减少频率。而目前国内关于Foxp3、NFAT1蛋白在儿童再障发病机制中的作用、两者之间的关系及其与再障预后的联系尚少见报道。目的本研究应用流式细胞术、免疫印迹试验（western-blotting）的方法检测慢性再障（CAA）患儿及正常儿童外周血单个核细胞中Treg细胞及在其发育和分型中起重要作用的转录因子Foxp3及NFAT1在蛋白水平的表达,探讨它们之间的相互关系及在再障的免疫学发病机制中的原理,为再障的防治提供可行思路,并为探究再障的免疫抑制治疗方法提供可能的理论依据。材料与方法 1研究对象收集郑州大学第三、第一附属医院2009年10月至2010年6月儿科住院及门诊的慢性再障患儿,将其分成两组：初治期22例和恢复期22例,每组中男12例,女10例,年龄2-11岁;正常对照组为我院外科近期无感染、无免疫相关性疾病患儿,共计15例,男8例,女7例,年龄1-11岁,其体检各项指标均在正常范围内。各组之间年龄差异均无统计学意义（P＞0.05）（见表3.1）。诊断及疗效标准均符合《小儿再障诊疗建议》,所有恢复期患儿均不需输血。 2方法应用流式细胞术检测外周血CD4+CD25int/highCDl 27low Treg细胞的表达水平;提取外周血单个核细胞,并提取该细胞中的总蛋白,用western-blotting的方法检测NFAT1、Foxp3蛋白的表达水平,实验所得的X光片结果应用扫描仪进行扫描,应用Quanity One软件分析图片中目的条带的平均灰度及背景灰度,前者减去后者作为统计分析的数值,各样品的最后统计数值为其灰度值与相应内参灰度值之比。 3统计学处理采用SPSS 16.0统计软件进行数据处理,所有原始数据均进行正态性、方差齐性检验,实验数据均以均数±标准差（x±s）表示,多样本均数间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）,组间比较分析采用LSD-t法,各变量之间的相关性分析采用P

关键词：再生障碍性贫血调节性T细胞 western-blotting NFAT1 Foxp3

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CCCTC-结合因子（CTCF）及端粒酶hTERT在人子宫内膜癌组织中的表达研究

CCCTC-结合因子（CTCF）及端粒酶hTERT在人子宫内膜癌组织中的表...

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作者：胡俊重庆医科大学

学位级别：硕士

第一部分应用western-blotting技术检测人子宫内膜癌组织中CTCF和端粒酶基因hTERT蛋白表达的研究目的：检测对比人子宫内膜癌和正常子宫内膜组织CTCF和端粒酶基因hTERT蛋白表达情况，结合临床病理参数分析子宫内膜癌组CTCF及hTERT分别... 详细信息

第一部分应用western-blotting技术检测人子宫内膜癌组织中CTCF和端粒酶基因hTERT蛋白表达的研究目的：检测对比人子宫内膜癌和正常子宫内膜组织CTCF和端粒酶基因hTERT蛋白表达情况，结合临床病理参数分析子宫内膜癌组CTCF及hTERT分别与之关联，最后分析CTCF与hTERT之间联系，为临床奠定一定基础。方法：随机选取30例正常人子宫内膜组织标本（其中15例增殖期内膜组织，15例分泌期内膜组织）为对照组，45例子宫内膜癌患者癌组织标本为实验组。采用western-blotting法检测CTCF蛋白和端粒酶基因hTERT（Human telomerase reverse transcriptase,hTERT）蛋白在各组的表达水平。结果：CTCF和hTERT在各组中均有表达。实验组CTCF蛋白和端粒酶基因hTERT蛋白阳性表达率均高于对照组。实验组与对照组间CTCF和端粒酶基因hTERT蛋白相对表达量均存在统计学差异。子宫内膜癌组CTCF表达与子宫内膜癌的病理分级、临床分期均有关，与病理类型无关;实验组hTERT表达与子宫内膜癌病理分级、病理类型、临床分期均无关。子宫内膜癌组CTCF与hTERT异常的表达存在正相关性。结论：CTCF与端粒酶基因hTERT蛋白在人子宫内膜癌和正常子宫内膜中表达存在差异性;不同临床病理参数下CTCF和hTERT表达情况各异;在子宫内膜癌中两者联合检测对子宫内膜癌的诊断具有一定的意义。第二部分应用半定量RT-PCR法检测人子宫内膜癌组织中CTCF和hTERTmRNA表达的研究目的：检测对比人子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织中CTCFmRNA与hTERTmRNA的表达情况，分析其临床意义。方法：从收集好的30例人正常子宫内膜标本（15例增殖期内膜组织，15例分泌期内膜组织）中挑选出WB实验CTCF表达阳性样本组织进行CTCFmRNA检测、hTERT表达阳性样本组织进行hTERTmRNA检测;从45例子宫内膜癌患者的癌组织标本中挑选出WB实验CTCF表达阳性样本组织进行CTCFmRNA检测、hTERT表达阳性样本组织进行hTERTmRNA检测;分别先后提取RNA,采用半定量RT-PCR法检测各标本中mRNA表达情况。结果：子宫内膜癌组CTCFmRNA和端粒酶hTERTmRNA各自相对表达量与对照组间存在统计学差异。结论：CTCFmRNA和端粒酶hTERTmRNA各自在实验组与对照组间存在不同，利用这一差异性可为临床诊断及治疗提供一定的基础。

关键词： CCCTC-结合因子(CTCF) 端粒酶基因hTERT蛋白 western-blotting 技术子宫内膜癌 CTCFmRNA 端粒酶 hTERTmRNA 半定量RT-PCR 子宫内膜癌

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奶牛隐孢子虫感染及微小隐孢子虫单抗的制备

奶牛隐孢子虫感染及微小隐孢子虫单抗的制备

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作者：曾晓华湖南农业大学

学位级别：硕士

标准微小隐孢子虫卵囊接种经地塞米松免疫抑制的昆明系15g雌性小白鼠,于感染后6天开始利用蔗糖不连续梯度离心法纯化卵囊,提取标准微小隐孢子虫卵囊和标准安氏隐孢子虫卵囊基因组DNA,参照NCBI上下载的18S rRNA的基因序列设计两对扩增引... 详细信息

标准微小隐孢子虫卵囊接种经地塞米松免疫抑制的昆明系15g雌性小白鼠,于感染后6天开始利用蔗糖不连续梯度离心法纯化卵囊,提取标准微小隐孢子虫卵囊和标准安氏隐孢子虫卵囊基因组DNA,参照NCBI上下载的18S rRNA的基因序列设计两对扩增引物,进行巢式PCR,对二次PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,得到508bp和514bp的两条电泳条带,回收PCR产物,ECOT14Ⅰ酶进行酶切后进行琼脂糖凝胶电泳和克隆测序,成功地建立了巢式PCR-RFLP检测隐孢子虫模型,并成功地鉴定微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫虫种。应用蔗糖不连续梯度离心法对采集自上海地区7个大型奶牛养殖场和个体养殖户养殖场奶牛粪便共691份进行了隐孢子虫卵囊的纯化,并利用基因组试剂盒提取隐孢子虫的基因组DNA,然后利用已建立好的巢式PCR-RFLP法进行检测,查出阳性样品奶牛场6个,占85.71%,在128头奶牛的粪便中检测出了隐孢子虫卵囊,阳性率为18.52%(128/691),说明上海地区确实有隐孢子虫感染。其中经鉴定128份阳性样品中有43份粪便中含微小隐孢子虫,微小隐孢子虫感染率为6.22%(43/691);85份粪便中含安氏隐孢子虫,安氏隐孢子虫感染率为12.3%(85/691);犊牛隐孢子虫感染率为26.03%(82/315),育成牛隐孢子虫感染率为15.38%(40/260),产奶牛隐孢子虫感染率为4.79%(7/146)。犊牛隐孢子虫感染率较育成牛、产奶牛高。奶牛场隐孢子虫感染率分别为39.58%、0、26.74%、3.80%、19.44%、12.71%、14.63%。样品微小隐孢子与NCBI公布的微小隐孢子虫同源性高达99.2%,与安氏隐孢子虫同源性仅为85.2%-85.8%;发现样品安氏隐孢子虫二次PCR扩增产物序列与NCBI公布安氏隐孢子虫同源性为97.6%-98.4%,与NCBI公布微小隐孢子虫同源性高仅为85.4%。利用经实验室鉴定的上海奶牛微小隐孢子虫卵囊接种于经地塞米松免疫抑制的昆明系15g雌性小白鼠,于感染后6天开始利用蔗糖不连续梯度离心法纯化卵囊,800rpm,离心5min,反复6次提纯后,通过液氮-37℃水浴反复冻融6次和超声波处理,取全卵囊抗原免疫BALB/c小鼠4次,以PEG1450为融合剂,取阳性的小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,先用HAT选择培养基培养,再换HT培养基继续培养,最后选取常规培养基培养。经间接ELISA方法筛选阳性克隆孔,有限稀释法进行3次克隆,获得2株分泌抗微小隐孢子虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D5和4E12。2株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1:3200和1:1600,腹水效价分别为1:102400和51200。采用免疫荧光法对2株单抗腹水进行初步鉴定,发现2株单抗均为抗卵囊壁单抗,无抗子孢子单抗。对2株单抗腹水提纯后进行SDS-PAGE电泳分析,其重链分子量为54kDa,轻链分子量为24kDa。经western-blotting分析,2株杂交瘤细胞分泌的单抗所识别的条带分别约为94 kDa和85 kDa。

关键词：巢式PCR-RFLP 微小隐孢子虫安氏隐孢子虫间接ELISA 有限稀释法杂交瘤细胞单克隆抗体免疫荧光法 SDS-PAGE western-blotting

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猪瘟地方流行株（BJCY/96）的全长ORF测序及E0基因的分段表达

猪瘟地方流行株（BJCY/96）的全长ORF测序及E0基因的分段表达

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作者：孔鹏中国兽医药品监察所

学位级别：硕士

本研究试图从分子生物学角度来揭示目前猪瘟仍频繁发生的原因，为广泛开展CSFV分子流行病学的研究提供基础资料，为CSF的防制提供科学依据和理论支持，为猪瘟诊断提供稳定的标准诊断抗原及诊断方法。本论文由2部分构成： 1．应用RT-PCR... 详细信息

本研究试图从分子生物学角度来揭示目前猪瘟仍频繁发生的原因，为广泛开展CSFV分子流行病学的研究提供基础资料，为CSF的防制提供科学依据和理论支持，为猪瘟诊断提供稳定的标准诊断抗原及诊断方法。本论文由2部分构成： 1．应用RT-PCR扩增了一株国内地方流行的CSF野毒全长ORF基因，对其进行了核苷酸序列测定及氨基酸序列推导，同时将其与C株、Alfort株、HCLV株和SM株进行了同源性比较及遗传进化分析，结果表明，地方流行野毒株与C株，Alfort株，HCLV株，SM株核苷酸序列同源性分别为95.8％、97.9％、95.7％和99.7％;氨基酸同源性分别为97.4％、98.7％、97.5％和99.7％。本次实验所测得序列与石门标准强毒株核苷酸同源性很高，与我国使用的疫苗株(HCLV)核苷酸同源性和C株则同源性大大降低，说明某些猪瘟病毒流行株的变异已经开始向远离疫苗株的方向变异，推测现行的猪瘟疫苗对某些地方流行株的保护作用可能已经降低。 2．应用RT-PCR技术对疫苗株(HCLV)、经典强毒株石门毒株(SM)EO基因分段进行扩增，得到约198bp、238bp、343bp的基因片段。将这3个基因分别克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确插入到表达载体中，且阅读框正确，从而构建成重组表达载体。重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，用SDS-PAGE电泳，western-blotting分析表达的蛋白。结果表明，EO基因几个片段均可以在大肠杆菌中表达，表达的蛋白以包涵体形式存在，表达产物的分子量约为36kDa、38kDa、42kDa(载体GST分子质量为29kDa、融合表达)，与理论推测的蛋白分子量一致;在western-blotting实验时，表达产物经SDS-PAGE电泳后，转移至NC膜上，在加一抗时选用不同的血清(SM毒攻毒后采集的猪阳性血清和HCLV株免疫后采集的血清)，进行交叉免疫学反应。表达产物pGEX-X、pGEX-Y和pGEX-Z以SM株为模板;pGEX-E、pGEX-F和pGEX-G以HCLV株为模板。结果表明SM阳性血清和HCLV阳性血清对pGEX-Y和pGEX-F片段(317—398AA)表达蛋白都可以发生反应。SM阳性血清与pGEX-X和pGEX-E片段(268—333AA)、pGEX-Z和pGEX-G片段表达蛋白(390—494AA)均可发生发生反应。而HCLV阳性血清只与pGEX-E和pGEX-G发生反应因为表达的重组蛋白可被猪瘟阳性血清所识别，表达蛋白可用于基因工程诊断抗原。

关键词：猪瘟病毒 E0基因同源性比较原核表达 western-blotting 抗原位点

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牦牛Ⅰ型干扰素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达分析

牦牛Ⅰ型干扰素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达分析

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作者：李玉萍兰州大学

学位级别：硕士

干扰素是机体细胞随病毒感染或其他生物因素诱生作用反应产生并分泌的一类具有多种生物活性的糖蛋白,能激活别的基因亚群进行转录,从而具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。干扰素-α(interferon-α)和干扰素-β(interferon-β)属Ⅰ型干... 详细信息

干扰素是机体细胞随病毒感染或其他生物因素诱生作用反应产生并分泌的一类具有多种生物活性的糖蛋白,能激活别的基因亚群进行转录,从而具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。干扰素-α(interferon-α)和干扰素-β(interferon-β)属Ⅰ型干扰素,分别由白细胞和纤维母细胞产生,具有广谱抗病毒活性和较强的免疫调节活性,对DNA病毒和RNA病毒均具有抑制作用。自1986年基因工程IFN-α2a和IFN-α2b、1990年基因工程IFN-β和1993年IFN-γ相继获准投放市场,基因工程干扰素受到越来越广泛的应用。为了研究和开发牦牛干扰素并用于相关疾病的预防和治疗,本研究克隆了牦牛干扰素-α-A、-α-Ⅱ及干扰素-β基因,并对其进行了原核表达。采集牦牛外周血分离淋巴细胞,用植物血凝素(PHA)刺激外周血淋巴细胞,提取总RNA,采用反转录PCR(RT-PCR)技术首先扩增出牦牛干扰素-α-A、α-Ⅱ及干扰素-β基因,将扩增到的基因与pGEM-T-easy载体连接、转化后,进行酶切、PCR以及测序鉴定。结果表明:牦牛IFN-α-A基因ORF为570bp,与乳牛IFN-α-A参考序列同源性为94.4%,与耕牛IFN-α-B同源性为96.8%,与水牛IFN-α-A同源性为62.6%,与猪、马、人IFN-α-A次之,分别为78.1%、77.1%、71.4%,与狗、试验小鼠、家鼠、鸡、家鹅IFN-α-A同源性在65.4%-30.0%之间;牦牛IFN-α-Ⅱ基因ORF为588bp,与乳牛IFN-α-Ⅱ参考序列同源性为94.2%,与耕牛IFN-σ-1同源性为95.3%,与水牛IFN-α-Ⅱ为92.8%,与马、猪、人IFN-α-Ⅱ分别为66.7%、63.2%和64.4%,与狗、实验鼠、家鼠、鸡和家鹅IFN-α-Ⅱ同源性59.2%-30.7%之间;牦牛IFN-β基因ORF为498bp,与乳牛IFN-β参考序列同源性最高,为98.6%,其次为猪、马、猫、人,分别为72.5%、68.9%、66.1%和63.5%,与狗、鼠、鸡等同源性都很低,不超过25%。分子遗传进化树分析表明:牦牛IFN-α-A与乳牛和耕牛亲缘关系都近,与水牛较远;牦牛IFN-α-Ⅱ与耕牛、乳牛和水牛亲缘关系近;与其它不同类动物相比较,二者均与猪、马、人、狗和鼠亲缘关系较近,而与鸡和鹅较远;牦牛与乳牛IFN-β亲缘关系最近,与猪、马的次之,而与鼠、狗、鸡等的亲缘关系较远。结果说明该三种基因均有种属差异性。依照各基因开放阅读框(ORF)两侧序列重新设计并合成表达引物,以重组质粒pGEM-T-easy/IFN-α-A、pGEM-T-easy/IFN-α-Ⅱ、pGEM-T-easy/IFN-β为模板进行扩增,扩增产物和pGEX-4T-1质粒分别用BamH Ⅰ和Xhol Ⅰ、BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后连接,转化大肠杆菌。经酶切、PCR以及测序鉴定证明,牦牛各基因正确插入到pGEX-4T-1载体。用ITPG诱导重组基因进行表达,表达产物通过SDS-PAGE和western-blotting分析,证实牦牛IFN-α-A、IFN-α-Ⅱ和IFN-β基因均在大肠杆菌中均得到了成功表达,目的蛋白与GST形成融合形式,IFN-α-A和IFN-α-Ⅱ分子量大小约为19ku左右,IFN-β分子量大小约为15ku左右,与预期的大小相吻合,而且可被鼠抗GST血清所

关键词：牦牛干扰素基因克隆诱导表达 western-blotting

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miR-146a在上皮性卵巢癌中的表达及调控机制初步研究

miR-146a在上皮性卵巢癌中的表达及调控机制初步研究

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作者：曾梦君中南大学

学位级别：硕士

目的：检测miR-146a在正常卵巢组织、良性上皮性卵巢肿瘤组织、上皮性卵巢癌组织中的表达水平并结合临床病理参数资料进行分析,初步探讨miR-146a在上皮性卵巢癌中发生发展过程中的可能作用;进一步检测正常卵巢组织和上皮性卵巢癌组织中m... 详细信息

目的：检测miR-146a在正常卵巢组织、良性上皮性卵巢肿瘤组织、上皮性卵巢癌组织中的表达水平并结合临床病理参数资料进行分析,初步探讨miR-146a在上皮性卵巢癌中发生发展过程中的可能作用;进一步检测正常卵巢组织和上皮性卵巢癌组织中miR-146a靶基因IR-AK1蛋白分子表达情况,初步探讨miR-146a在上皮性卵巢癌中可能的分子调控通路。研究方法：1.采用实时荧光定量PCR法检测正常卵巢组织、良性上皮性卵巢肿瘤组织、上皮性卵巢癌组织中miR-146a的相对表达水平,并分析miR-146a表达和各临床病理参数的关系。2.运用western-blotting检测正常卵巢组织和上皮性卵巢癌组织中miR-146a靶基因IRAK1蛋白分子相对表达水平并分析上皮性卵巢癌中miR-146a与IRAK1表达相关性。结果：1.在正常的卵巢组织、良性上皮性卵巢肿瘤以及上皮性卵巢癌组织中,miR-146a的相对表达量逐渐升高,与正常卵巢组织相比,miR-146a表达在良性上皮性卵巢肿瘤及上皮性卵巢癌组织中明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。3.与正常卵巢组织相比,IRAKI蛋白表达水平在过表达miR-146a的上皮性卵巢癌组织中明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),且两者表达水平呈明显的负相关(r=-0.78,P<0.05)。结论：1.上皮性卵巢癌组织中miR-146a表达水平相比于正常卵巢组织和良性卵巢上皮性肿瘤组织明显上调,可能参与了上皮性卵巢癌的发生及调控。***-146a表达水平在上皮性卵巢癌低分化组中明显高于高-中分化组,miR-146a可能与上皮性卵巢癌肿瘤细胞恶性程度有关。3.过表达miR-146a的上皮性卵巢组织中IRAK1蛋白分子显著下调,两者呈显著负相关,在蛋白分子水平上支IRAK1是miR-146a的靶基因,miR-146a可能通过靶向抑制IRAK1mRNA的翻译,调控上皮性卵巢癌细胞的生物学功能。

关键词：上皮性卵巢癌 miR-146a IRAK1 PCR western-blotting

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杂色曲霉菌变应原的分离、纯化和鉴定

杂色曲霉菌变应原的分离、纯化和鉴定

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作者：喻海琼江西医学院

学位级别：硕士

真菌是引起过敏反应的一种重要的吸入性过敏原，空气传播的真菌孢子，菌丝和碎片与呼吸道及皮肤过敏症状密切相关。真菌的种类繁多分布广泛，其中杂色曲霉菌是湿热沿海及内地常见的气传真菌，目前有关杂色曲霉菌变应原的分离、纯化及免... 详细信息

真菌是引起过敏反应的一种重要的吸入性过敏原，空气传播的真菌孢子，菌丝和碎片与呼吸道及皮肤过敏症状密切相关。真菌的种类繁多分布广泛，其中杂色曲霉菌是湿热沿海及内地常见的气传真菌，目前有关杂色曲霉菌变应原的分离、纯化及免疫学鉴定的研究国内外均未见报道。本研究有助于临床真菌过敏性疾病的诊断并为特异性治疗奠定基础。本研究通过Coca’s提取法得到杂色曲霉菌的菌丝及孢子粗浸液，丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示粗提液含20余种蛋白质组分。采用western-blotting法和曲霉菌过敏病人血清鉴定其主要和次要变应原，结果显示分子量为17kDa、20kDa和67kDa的蛋白质对超过50%的曲霉菌过敏病人IgE结合阳性，证实为杂色曲霉菌主要变应原，而分子量为19kDa、22kDa、35kDa和76kDa的蛋白质与曲霉菌过敏病人血清IgE结合阳性少于50%，为杂色曲霉菌次要变应原。通过DEAE-纤维素（DE-52）离子交换层析和Sephacryl S-200凝胶层析纯化变应原，得到分子量为20kDa主要变应原和35kDa的次要变应原成分，回收率为31.84%。

关键词：杂色曲霉菌变应原 SDS-PAGE western-blotting 离子交换层析凝胶层析

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HMGB1在卵巢子宫内膜异位中的表达及意义

HMGB1在卵巢子宫内膜异位中的表达及意义

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作者：周美浓中南大学

学位级别：硕士

目的：研究HMGB1在卵巢子宫内膜异位症中的表达及临床意义。方法：采用RT-PCR和western-blotting检测HMGB1mRNA和HMGB1蛋白在29例卵巢子宫内膜异位症患者异位子宫内膜和在位内膜及29例非子宫内膜异位症患者的在位内膜中(对照组)的表达... 详细信息

目的：研究HMGB1在卵巢子宫内膜异位症中的表达及临床意义。方法：采用RT-PCR和western-blotting检测HMGB1mRNA和HMGB1蛋白在29例卵巢子宫内膜异位症患者异位子宫内膜和在位内膜及29例非子宫内膜异位症患者的在位内膜中(对照组)的表达情况。结果：HMGB1mRNA在卵巢异位子宫内膜、在位内膜和非异位症的在位内膜均有表达,其表达灰度值为：卵巢异位内膜组：0.5438±0.0565,在位内膜组：0.3016±0.0614,对照组：0.1536±0.0444(p<0.05)三组之间有明显差异;ANOVA分析F=185.625,(p<0.0001);2) HMGB1蛋白：卵巢异位内膜组：0.8399±0.0287;在位内膜组：0.4010±0.0643;对照组：0.1999±0.0716(p<0.05)三组之间有明显差异,且两两之间差异有显著性,F=377.923,(p<0.0001)。HMGB1在卵巢子宫内膜异位症中异位内膜中的表达与分期有关,与病程、肿瘤大小、患者年龄无明显相关。结论：***1在卵巢子宫内膜异位中的高表达,说明可能在卵巢子宫内膜异位症的发生、发展中起重要作用。***1随着临床分期的增加而表达明显,说明与病变程度生物学行为有密切关切,有可能成为监测子宫内膜异位症病情严重程度的标记物。

关键词：卵巢子宫内膜异位症 HMGB1 RT-PCR western-blotting

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二硫化碳对大鼠神经组织抗氧化系统及微管和微丝表达的影响

二硫化碳对大鼠神经组织抗氧化系统及微管和微丝表达的影响

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作者：潘光兵山东大学

学位级别：硕士

目的二硫化碳(CS)是一种重要的化工原料，可以引起中毒性周围神经病，其发病机制目前还不清楚。本研究通过建立CS亚慢性中毒大鼠模型，测定中毒大鼠大脑、小脑、脊髓和坐骨神经中谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)含量和超氧化... 详细信息

目的二硫化碳(CS)是一种重要的化工原料，可以引起中毒性周围神经病，其发病机制目前还不清楚。本研究通过建立CS亚慢性中毒大鼠模型，测定中毒大鼠大脑、小脑、脊髓和坐骨神经中谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)含量和超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总抗氧化能力(T-AOC)和过氧化氢酶(CAT)活性的变化，为进一步探讨CS2引起的中毒性周围神经病的发病机制提供依据。并观察脊髓组织中微管和微丝相对含量的变化，利用RT-PCR的方法研究二硫化碳对脊髓组织中微管和微丝在转录水平的影响，初步探索二硫化碳导致骨架蛋白变化的发生机理。方法 ***雄性大鼠60只，体重180～220 g，由山东大学实验动物中心提供。饲养7 d后，随机分为对照组、300mg／kg剂量组、500mg／kg剂量组，每组20只。二硫化碳溶于玉米胚油中，2.5ml／kg体积灌胃腹腔染毒，对照组用同体积玉米油灌胃，5次／周，连续12周。 2．密切观察各组大鼠一般状况的变化，每周测量体重，并用神经行为学方法定期测量压痛阈值、后肢撑力、转棒、网格指数等神经行为学指标。 3．至试验结束时，断头处死大鼠，取大脑、小脑、脊髓、坐骨神经，用生物化学方法测定大脑、小脑、脊髓和坐骨神经匀浆中谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)含量和超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、总抗氧化能力(T-AOC)和过氧化氢酶(CAT)活性的变化。 4．分离脊髓组织，制备匀浆，100000×g、4℃离心60min。利用western-blotting的方法研究二硫化碳中毒大鼠脊髓组织匀浆上清和沉淀中β-actin、α-tubulin、β-tubulin等骨架蛋白相对含量的变化。 5．分离脊髓组织，Trizol法提取组织中总RNA，利用RT-PCR的方法观察β-actin、α-tubulin、β-tubulin mRNA的表达水平。结果 1．二硫化碳染毒对大鼠体重和神经行为的影响实验结束时，染毒组大鼠体重和各项行为学指标与对照组相比均有显著性差异，并在整个实验过程中呈现一定的剂量-时间-效应关系。与对照组相比，低剂量组体重降低21％(P＜0．01)，高剂量组降低37％(P＜0．01)。高剂量组和低剂量组大鼠在热板仪上保持时间分别从第8和第10周开始比对照组明显延长，至试验结束时，低剂量组延长28％(P＜0．01)，高剂量组延长70％(P＜0.01)。与对照组相比，高剂量组和低剂量组大鼠分别从第6和第8周开始对压痛的感觉开始明显迟滞，至试验结束，两组大鼠压痛阈值分别增加33％(P＜0.01)和60％(P＜0.01)。大鼠在网格上停留的时间缩短，至试验结束时，低剂量组和高剂量组大鼠网格指数分别下降了35％(P＜0.01)和42％(P＜0.01)。大鼠的后肢撑力下降，试验结束时，与对照组相比，低剂量组后肢撑力指数增加21％(P＜0.01)，高剂量组增加24％(P＜0.01)。 2．二硫化碳对神经组织中抗氧化系统的影响 (1)大脑中抗氧化系统指标的变化与对照组相比，高剂量组大鼠大脑中MDA和ROS分别上升了33％(P＜0.01)和35％(P＜0.01)，而在低剂量组分别上升了20％(P＜0.01)和20％(P＜0.01)。高剂量组大鼠大脑中GSH、GSH-Px、SOD、T-AOC和CAT分别下降了27％(P＜0.01)，12％(P＜0.01)，30％(P＜0.01)，21％(P＜0.01)和40％(P＜0.01)。低剂量组GSH、，T-AOC和CAT分别下降了18％(P＜0.01)，11％(P＜0.05)和18％(P＜0.01)，GSH-Px与SOD未见明显变化。 (2)小脑中抗氧化系统指标的变化与对照组相比，高剂量组大鼠小脑中MDA和ROS分别上升了23％(P＜0.01)和19％(P＜0.01)，而在低剂量组分别上升了9％(P＜0.05)和13％(P＜0.05)。高剂量组大鼠小脑中GSH、GSH-Px、SOD、T-AOC和CAT分别下降了27％(P＜0.01)，15％(P＜0.01)，26％(P＜0.01)，21％(P＜0.01)和25％(P＜0.01)。低剂量组GSH下降了10％(P＜0.05)，T-AOC、CAT、GSH-Px与SOD未见明显变化。 (3)坐骨神经中抗氧化系统指标的变化与对照组相比，高剂量组大鼠坐骨神经中MDA和ROS分别上升了23％(P＜0.01)和53％(P＜0.01)，低剂量组MDA上升了23％(P＜0.01)，ROS未见明显改变。高剂量组大鼠坐骨神经中GSH、GSH-Px、SOD、T-AOC和CAT分别下降了20％(P＜0.01)，21％(P＜0.01)，30％(P＜0.01)，

关键词：二硫化碳神经退行性变脂质过氧化微管微丝 western-blotting RT-PCR

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