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五子衍宗丸对TAp73基因抑制所致少弱精子症模型小鼠的防治作用及机制研究

五子衍宗丸对TAp73基因抑制所致少弱精子症模型小鼠的防治作用及...

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作者：刘红娟安徽中医药大学

学位级别：硕士

目的本文旨在考察抑制TAp73基因对精子质量的影响,建立TAp73基因抑制的少弱精子症(oligoasthenospermia,OA)模型,并通过经典复方制剂五子衍宗丸(Wuzi-Yanzong-Wan,WZYZW)对TAp73基因抑制小鼠进行干预,探讨其作用机制,以期寻求治疗男性... 详细信息

目的本文旨在考察抑制TAp73基因对精子质量的影响,建立TAp73基因抑制的少弱精子症(oligoasthenospermia,OA)模型,并通过经典复方制剂五子衍宗丸(Wuzi-Yanzong-Wan,WZYZW)对TAp73基因抑制小鼠进行干预,探讨其作用机制,以期寻求治疗男性不育的新途径。方法实验一:基于TAp73基因抑制的OA小鼠模型的研究取体重为18-22 g的C57BL/6雄性小鼠20只,随机分为正常对照组和Pifithrin-α组。Pifithrin-α组连续腹腔注射Pifithrin-α(2.5mg/kg)30天,正常对照组给与等量溶剂。30天后称重法检测动物体重、脏器重量,计算脏器系数;Makler精子计数仪分析精子质量(密度、活力、活率和畸形率);流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测精子凋亡率;原位末端转移酶标记技术(Terminal deoxynucleotidyl transferase d UTP nick-end labeling,TUNEL)检测睾丸组织GC凋亡率;酶联免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定血清激素水平;苏木素伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色法和透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)观察睾丸组织病理改变和血睾屏障(Blood-testis barrier,BTB)、外质特化(Ectoplasmic specialization,ES)等细胞连接结构变化;实时定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)技术和蛋白质印迹(Western bloting,WB)法测定TAp73、Nectin-2、闭锁连接蛋白-1(Zonula occludens-1,ZO-1)表达情况实验二:五子衍宗丸对TAp73基因抑制所致少弱精子症模型小鼠的影响将60只C57BL/6雄性小鼠随机分成正常对照组、模型组、生精胶囊(Shengjing-Jiaonang,SJJN)组(1.6 g/kg)、WZYZW低、中、高剂量组(1.0、2.0、4.0 g/kg),每组10只,除正常对照组外其余各组连续腹腔注射Pifithrin-α(2.5mg/kg)30天,制备TAp73基因抑制OA模型。造模同时各组按剂量灌胃给药,正常组、模型组给予等容量蒸馏水,连续30天,末次给药后收集动物血液、睾丸、附睾组织。称重法检测动物体重、脏器重量,计算脏器系数;Makler精子计数仪分析精子质量(密度、活力、活率);FCM检测精子凋亡率;ELISA法测定血清激素水平;HE染色和TEM观察睾丸组织病理改变和BTB、ES等细胞连接结构变化;RT-PCR技术和WB方法测定TAp73、integrin-α6、N-Cadherin、Nectin-2、Occludin等细胞粘附因子表达情况。结果实验一:与正常对照组相比,Pifithrin-α组小鼠精子密度和精子活力显著降低,TAp73和Nectin-2基因表达被抑制,睾丸组织紧密连接(Tight junction,TJ)和顶端ES结构紊乱。实验二:与正常对照组相比,模型组小鼠体重、心、肝、肺、肾、睾丸等脏器系数无明显变化;附睾系数、精子质量、睾酮(Testosterone,T)水平显著下降,精子凋亡率、畸形率明显增加,睾丸出现病理性损伤,TJ和顶端ES出现严重异常;Occludin蛋白表达异常增加,TAp73、integrin-α6、N-Cadherin、Nectin-2等表达显著下降。与模型组相比,WZYZW各组能明显提高精子质量和T水平,显著降低精子畸形率及凋亡率,改善睾丸组织病理损伤及TJ和顶端ES的异常变化;明显降低Occludin蛋白表达并显著提高TAp73、integrin-α6、N-Cadherin、Nectin-2等表达。结论通过连续30天腹腔注射Pifithrin-α(2.5 mg/kg),成功制备出TAp73基因抑制的OA小鼠模型。TAp73基因抑制可导致精子发生及成熟障碍,可能是OA潜在发病机制;WZYZW通过增加TAp73基因的表达,影响细胞粘附分子,调节睾丸组织的细胞连接动态重塑,对TAp73抑制所致OA有一定的防治作用。

关键词： WZYZW OA TAp73 Nectin-2 细胞连接

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