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海洋科学 2010年第12期34卷 1-7页

作者：宋光年金松君张继泉相建海中国科学院海洋研究所山东青岛266071 中国科学院研究生院北京100049

利用细胞凋亡来清除多细胞器官受损伤或有害的细胞,为动物发育过程中保持机体平衡起到关键作用。为了研究细胞凋亡在甲壳类动物应对病毒感染后所起到的作用,作者利用同源克隆技术获得了中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)caspase基因... 详细信息

利用细胞凋亡来清除多细胞器官受损伤或有害的细胞,为动物发育过程中保持机体平衡起到关键作用。为了研究细胞凋亡在甲壳类动物应对病毒感染后所起到的作用,作者利用同源克隆技术获得了中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)caspase基因(FcCasp)的cDNA序列,并分析了该基因在对虾受到白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,简称wssv)刺激后的表达变化规律。结果表明,该基因的cDNA含有954个核苷酸,编码317个氨基酸,具有caspase家族典型的QACRG五肽蛋白酶活性位点(190-194氨基酸)。对注射了wssv的中国明对虾FcCasp的表达进行分析,在5个时间点取其肝胰脏样本,经real-time PCR检测发现,wssv刺激3 h后,对虾肝胰脏中FcCasp的表达呈现显著性上调,说明FcCasp的表达与wssv感染密切相关,提示FcCasp基因与细胞凋亡相关。

关键词：中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis) 基因克隆 Caspase wssv攻毒实时定量PCR分析

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中国明对虾凋亡基因caspase的克隆、表达及功能的初步分析

中国明对虾凋亡基因caspase的克隆、表达及功能的初步分析

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作者：宋光年中国科学院研究生院（海洋研究所）

学位级别：硕士

对虾是最重要的海水养殖产品之一,但是对虾病害在世界范围内的广泛传播,给水产养殖和沿海农村经济造成了重大损失。自1993年对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus, wssv)暴发以来,中国明对虾的养殖一直一蹶不振,白斑病毒已成... 详细信息

对虾是最重要的海水养殖产品之一,但是对虾病害在世界范围内的广泛传播,给水产养殖和沿海农村经济造成了重大损失。自1993年对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus, wssv)暴发以来,中国明对虾的养殖一直一蹶不振,白斑病毒已成为危害对虾养殖的最主要病原。因此,解决这一问题的关键是加强对对虾的非特异性免疫系统的研究,从而在此基础上探索对虾病害防治的新途径。本论文根据其他无脊椎动物中caspase基因的保守氨基酸序列设计简并引物,从中国明对虾血细胞cDNA中克隆到了caspase基因片段,命名为FcCasp。FcCasp的cDNA含有954个核苷酸,编码317个氨基酸, FcCasp蛋白的预测分子量为35592.8 Da,理论等电点为5.37。通过功能域分析发现FcCasp推导的氨基酸序列中含有一个caspase家族典型的QACRG五肽保守序列(定位在190-194位氨基酸)。P20大亚基定位在67-196位氨基酸,P10小亚基定位在218-317位氨基酸。分析了FcCasp在血细胞、淋巴器官、肠和肝胰脏等7个组织中的表达水平。组织表达结果表明FcCasp在血细胞、肝胰脏和淋巴器官中表达水平明显高于其他组织,而淋巴器官和血细胞是对虾免疫系统中最重要的两个组织,由此可以推测中国明对虾中的FcCasp可能与免疫关系密切。本论文还利用实时荧光定量PCR技术,对wssv病毒刺激后,对虾肝胰脏中FcCasp基因的转录水平进行了研究。用wssv病毒刺激后,在不同时间提取对虾肝胰腺总RNA,进行Real-time PCR分析,结果发现FcCasp基因在病毒刺激后有上调表达,这说明FcCasp对wssv病毒刺激产生了应答,提示FcCasp基因可能参与中国明对虾的先天免疫防御,并与细胞凋亡相关。为了进一步了解FcCasp在细胞凋亡中的作用,采用RNAi技术抑制FcCasp基因的表达。结果表明,当FcCasp基因的转录表达受到抑制时,对虾的血细胞凋亡也受到抑制,这说明FcCasp基因直接参与细胞凋亡。

关键词：中国明对虾 Caspase基因克隆 wssv攻毒实时定量PCR分析 RNAi 流式细胞仪

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