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siRNA特异性抑制水通道蛋白-1基因在人羊膜wish细胞的表达

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siRNA特异性抑制水通道蛋白-1基因在人羊膜WISH细胞的表达

作者：郝荣增西北农林科技大学

学位级别：硕士

母胎液体交换及羊水循环平衡对于正常妊娠胎儿的生长、活动和发育至关重要。胎盘和胎膜是维持母胎液体平衡的重要器官。羊水量异常是临床上常见的母胎液体交换障碍疾病之一,临床上表现为羊水过多或羊水过少,其围产儿病率和死亡率显著升... 详细信息

母胎液体交换及羊水循环平衡对于正常妊娠胎儿的生长、活动和发育至关重要。胎盘和胎膜是维持母胎液体平衡的重要器官。羊水量异常是临床上常见的母胎液体交换障碍疾病之一,临床上表现为羊水过多或羊水过少,其围产儿病率和死亡率显著升高。但羊水平衡的分子机制仍不清楚。目前研究认为羊水膜内转运吸收是维持羊水稳态平衡的重要方式,但其分子机制尚不清楚。水通道蛋白(Aquanproin, AQP)是一族介导水跨膜转运的膜孔蛋白,在机体内器官的液体平衡中发挥着关键作用,但其在羊水平衡中的作用机理还不清楚。RNA干扰技术是近年来用于哺乳动物细胞培养研究的新方法,用以使目的基因表达沉默,进而分析其功能。人羊膜wish细胞株源于正常足月妊娠的人羊膜上皮细胞。为了研究AQP在母胎液体平衡的作用,建立研究羊膜AQPs在羊水量平衡中作用及其调节机制的细胞模型,本研究应用RNA干扰技术研究特异性siRNA(small interference RNA)对细胞AQP1 mRNA表达的抑制作用。结果如下: 1.本研究运用RT-PCR和细胞免疫荧光化学技术,检测人羊膜wish细胞中AQP1, 3, 8, 9的表达,结果表明AQP1, 3, 8, 9在人羊膜上皮wish细胞均有表达,AQP1, 3, 8, 9 mRNA的表达水平分别约为0.489±0.103, 0.594±0.093, 0.474±0.136, 0.425±0.150( x±S)。细胞免疫荧光技术在蛋白水平显示AQP1, 3, 8, 9在人羊膜wish细胞表达。结论认为,wish细胞可以作为研究羊膜水通道蛋白对水转运及调控机制的细胞模型。 2.本研究运用0 nmol/L, 5 nmol/L, 10 nmol/L, 20 nmol/L和30 nmol/L CY3-Negative siRNA转染人羊膜上皮wish细胞,以确定其转染效率。转染后24 h,荧光显微镜观察细胞内可见红色荧光,而对照组未见到荧光信号,说明化学合成siRNA可以被有效转入细胞,荧光为特异性荧光信号。流式细胞仪检测转染效率分别为:0, 7.7%, 39.35%, 87.27%和95.78%;20 nmol/L和30 nmol/L转染组的转染效率显著高于5 nmol/L和10 nmol/L组(P0.05)。运用20 nmol/L的Negative siRNA转染细胞24 h后,Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒检测转染对细胞凋亡的影响,结果转染组和对照组细胞早期凋亡率分别为1.96%和2.36%,两组之间细胞凋亡率无显著差异(P>0.05)。结论认为,20 nmol/L的siRNA即可获得理想的转染效果;转染效率随siRNA浓度增加而升高;化学合成siRNA转染对细胞凋亡无明显影响。 3.本研究应用化学合成的3条不同序列AQP1-siRNA,终浓度均为20 nmol/L,分别转染细胞24 h,筛选抑制效率最高的siRNA,结果表明AQP1-siRNA-1抑制作用最强;然后分别应用20 nmol/L, 40 nmol/L, 60 nmol/L和80 nmol/L的AQP1-siRNA-1转染细胞,研究不同浓度的siRNA对细胞AQP1 mRNA表达的抑制作用;转染24 h后荧光定量PCR检测,结果各组AQP1 mRNA的表达水平分别降低20.42%, 39.86%, 60.34%和65.81%;阴性对照组AQP1 mRNA表达为空白组的95.7%,与空白对照组无显著性差异(P>0.05)。 4.本研究运用60 nmol/L AQP1-siRNA-1转染细胞,转染分别培养24 h, 48 h和72 h,研究siRNA的有效作用时间。荧光定量PCR检测结果发现,各组AQP1 mRNA分别较空白组下调60.24%, 90.57%, 87.68%。以48 h转染组AQP1 mRNA表达降低最为显著(P0.05)。结论认为,siRNA对AQP1 mRNA表达的抑制作用在24 h2 h呈时间依赖性升高,最大抑制作用在48 h,有效抑制时间达72 h。总之,本研究检测了AQP1, 3, 8, 9在人羊膜wish细胞的表达,优化了siRNA转染wish细胞的条件,筛选出有效抑制AQP1 mRNA表达的siRNA序列;最后应用AQP1-siRNA成功抑制了wish细胞AQP1 mRNA表达,建立了AQP1基因沉默的羊膜上皮细胞模型。

关键词：水通道蛋白小干扰RNA wish细胞转染母胎液体平衡

H5亚型禽流感病毒HA基因在wish细胞中的瞬时表达

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中国农学通报 2008年第3期24卷 5-8页

作者：张蕾张大鹏吴东林王诺明宇张慧瑛张瑞兴张玉静吉林大学畜牧兽医学院长春市动物卫生监督所长春130021 长春市疾病预防控制中心长春130033

在wish细胞中,对H5亚型禽流感病毒HA基因进行了瞬时表达的研究。首先构建了真核表达质粒pVAX-H5HA,通过酶切和PCR筛选阳性克隆后测序。然后将重组表达质粒以脂质体介导法转染wish细胞,通过RT-PCR在转录水平检测目的基因的表达,间接免疫... 详细信息

在wish细胞中,对H5亚型禽流感病毒HA基因进行了瞬时表达的研究。首先构建了真核表达质粒pVAX-H5HA,通过酶切和PCR筛选阳性克隆后测序。然后将重组表达质粒以脂质体介导法转染wish细胞,通过RT-PCR在转录水平检测目的基因的表达,间接免疫荧光检测目的蛋白。结果表明,HA基因在wish细胞中进行了表达。

关键词： H5亚型禽流感病毒 HA基因 wish细胞瞬时表达

AQP8在人羊膜上皮细胞wish株中的表达及调控机制研究

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AQP8在人羊膜上皮细胞WISH株中的表达及调控机制研究

作者：李莉重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:羊水膜内转运是羊水吸收的重要调节方式,对羊水量的平衡起了重要作用,但其细胞和分子机制还不清楚。通过研究人羊膜上皮细胞AQP8的表达和调控,探讨羊水跨膜转运机制,为临床羊水量异常寻找治疗策略提供理论依据。方法:(1)培养人羊... 详细信息

目的:羊水膜内转运是羊水吸收的重要调节方式,对羊水量的平衡起了重要作用,但其细胞和分子机制还不清楚。通过研究人羊膜上皮细胞AQP8的表达和调控,探讨羊水跨膜转运机制,为临床羊水量异常寻找治疗策略提供理论依据。方法:(1)培养人羊膜上皮细胞wish株。随机分为实验组和对照组,对照组予以正常培养液常规培养。实验组分为3组:低渗组、高渗透组、环磷酸腺苷(cycliadenosine monophosphate,cAMP)组。低渗透组将细胞培养液稀释至80%,60%两组,继续培养羊膜上皮细胞;高渗组将细胞培养液浓缩至120%,140%两组,继续培养羊膜上皮细胞;cAMP组将8-Br-cAMP加入培养液,使其在细胞培养液中浓度分别为10μM、20μM、40μM、100μM、200μM、400μM,分别培养羊膜上皮细胞。各组分别在培养2h、4h、8h、16h、24h和48h时取样。各组重复培养6瓶(。2)采用Western blot技术定量检测wish细胞AQP8蛋白表达。(3)采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术半定量检测wish细胞AQP8 mRNA的表达。(4)采用免疫荧光组织化学方法原位检测wish细胞上AQP8的分布。

关键词：水通道蛋白8 wish细胞羊水量渗透压环磷酸腺苷

水通道蛋白8在人羊膜上皮细胞wish株的表达和定位

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重庆医科大学学报 2007年第6期32卷 565-567,574页

作者：李莉漆洪波重庆市妇幼保健院重庆400013 重庆医科大学附属第一医院妇产科重庆400016

目的:研究水通道蛋白8(AQP8)在人羊膜上皮细胞wish株的表达和定位,羊水膜内吸收的分子机制。方法:培养人羊膜上皮细胞wish株,采用Western blot技术检测wish细胞AQP8蛋白表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测wish细胞AQP8 mRNA的表达... 详细信息

目的:研究水通道蛋白8(AQP8)在人羊膜上皮细胞wish株的表达和定位,羊水膜内吸收的分子机制。方法:培养人羊膜上皮细胞wish株,采用Western blot技术检测wish细胞AQP8蛋白表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测wish细胞AQP8 mRNA的表达,免疫荧光组织化学方法检测wish细胞上AQP8的分布。结果:wish细胞能表达较低水平的AQP-8 mRNA,wish细胞AQP8蛋白在34ku处有一明显的糖基化条带。在细胞内微粒体膜和细胞膜上均检测到标记AQP8的荧光。结论:人羊膜上皮细胞wish有AQP8的蛋白和mRNA表达,AQP8可能介导了羊水膜内吸收。

关键词：水通道蛋白8 wish细胞羊水调控

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两种细胞株检测重组犬α-干扰素效价的比较

中国预防兽医学报 2009年第7期31卷 549-552页

作者：胡勇俞海洋刘伯玉赵俊汤仁树陈伟沈杭梅杨王明丽安徽医科大学微生物学教研室安徽合肥230032

本研究采用人羊膜细胞wish株和人喉癌上皮细胞Hep-2株,以微量细胞病变抑制法(CPE抑制法)对同批次的8组重组犬α干扰素样品进行了效价检测,以中国药品生物制品检定所使用的标化重组人α干扰素为标准,将在两株细胞上所测结果进行比较。其... 详细信息

本研究采用人羊膜细胞wish株和人喉癌上皮细胞Hep-2株,以微量细胞病变抑制法(CPE抑制法)对同批次的8组重组犬α干扰素样品进行了效价检测,以中国药品生物制品检定所使用的标化重组人α干扰素为标准,将在两株细胞上所测结果进行比较。其检测的结果具有很好的相关性(r=0.9976,p>0.05),并且重复性较好。用结晶紫染色法评价干扰素效价能够准确地反应细胞的状态,所得结果准确、客观。表明Hep-2与wish细胞测定结果没有差异,该方法可用于重组犬干扰素制品的效价测定。此外本研究还测定了最适试验条件如细胞浓度、接种用病毒滴度、加样方法等。

关键词：重组犬α干扰素效价 wish细胞 Hep-2细胞

半乳糖胺-凝集素/糖胺聚糖途径对PROM患者胎膜愈合影响的分子机制研究

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半乳糖胺-凝集素/糖胺聚糖途径对PROM患者胎膜愈合影响的分子机制...

作者：陈佳乐安徽医科大学

学位级别：硕士

背景:胎膜早破(Preterm premature rupture of membranes,PROM)是指分娩前胎膜的过早破裂。PROM导致新生儿发生呼吸窘迫综合征、新生儿败血症、母体绒毛膜羊膜炎、感染性子宫内膜炎、胎盘早剥等,严重损害孕产妇及新生儿的健康。目前针对... 详细信息

背景:胎膜早破(Preterm premature rupture of membranes,PROM)是指分娩前胎膜的过早破裂。PROM导致新生儿发生呼吸窘迫综合征、新生儿败血症、母体绒毛膜羊膜炎、感染性子宫内膜炎、胎盘早剥等,严重损害孕产妇及新生儿的健康。目前针对PROM尚无有效的早期检测方法、预防和治疗手段,促进胎膜组织愈合是预防PROM的研究热点。其中羊膜组织是胎膜的主要承重结构,羊膜创伤愈合机制涉及不同的动态过程,从炎症(包括组织清创和细胞黏附的动态变化)开始,然后是再上皮化(包括细胞迁移和增殖),最后是整体组织重塑。近年来研究表明,阴道微生物群及其代谢产物在PROM中可能起着关键作用,但其在胎膜愈合中作用尚未研究。本研究旨在明确阴道微生物群代谢产物在PROM患者胎膜愈合中的作用,探索PROM治疗的潜在靶点。方法:1.建立前瞻性研究队列,运用非靶向代谢组学检测PROM组(10例)和正常组(HC组)(10例)之间的小分子代谢产物,筛选出差异性代谢产物。2.利用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis-α,TNF-α)对wish细胞(人羊膜上皮细胞)进行刺激构建体外炎症模型,加入差异性代谢产物,通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)实验分析差异性代谢产物对体外炎症模型的影响,检测细胞上清中半乳糖凝集素的含量。3.利用脂多糖(lipoplysaccharide,LPS)对wish细胞进行刺激构建氧化应激模型,加入差异性代谢产物,通过活性氧(reactive oxygen species,ROS)荧光探针实验分析差异性代谢产物对体外氧化应激模型的影响。4.消化法原代培养羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,h AECs),运用免疫荧光(immunofluorescence,IF)鉴定羊膜上皮细胞。运用划痕、transwell迁移、细胞活力检测(cholecystokinin octapeptide,CCK-8)、蛋白印迹(western-blot,WB)、ELISA等实验分析研究差异性代谢产物对h AECs和wish细胞的迁移、增殖、上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)以及蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)通路的影响。5.通过二甲基亚甲蓝(dimethyl methylene blue,DMMB)比色法和ELISA检测加入差异性代谢产物后糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)和透明质酸(hyaluronic acid,HA)的含量,验证D-Gal NAc对细胞外基质的影响即对羊膜伤口愈合中组织重塑的影响。结果:1.对20名受试者阴道分泌物进行非靶向代谢组学检测,研究发现N-乙酰-d-半乳糖胺(N-acetyl-d-galactosamine,D-Gal NAc)在PROM组中显著低于HC组(P=0.0025)。2.D-Gal NAc预处理降低TNF-α刺激的wish细胞白介素-6(interleukin 6,IL-6)的表达(Pwish细胞ROS的表达(Pwish细胞的迁移,通过Akt信号通路部分EMT达到促进胎膜愈合(Pwish细胞的活性无影响(P>0.05)。4.D-Gal NAc上调wish细胞中糖胺聚糖的表达(P0.05)。结论:通过非靶向代谢组学分析得知多条代谢信号通路参与了阴道微生态失调可能导致PROM的发生,小分子差异性代谢产物主要有D-Gal NAc,推测D-Gal NAc对胎膜组织具有保护效能,对PROM具有防治作用。D-Gal NAc促进gal-1、gal-3的表达抑制细胞中IL-6和ROS的产生,表明D-Gal NAc可以通过抗炎和抗氧化应激的作用,在羊膜组织愈合的炎症阶段发挥作用。D-Gal NAc能够激活Akt信号通路加速EMT促进细胞迁移和GAG生成,在羊膜伤口愈合的EMT、迁移阶段和重塑阶段发挥作用。D-Gal NAc在羊膜伤口愈合的各个阶段发挥作用,具有促进胎膜早破患者羊膜组织愈合的潜能,有较好的实际应用意义。

关键词：胎膜早破 N-乙酰-d-半乳糖胺 wish细胞羊膜上皮细胞半乳糖凝集素

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干扰素生物活性两种测定方法的比较研究

中国医药导报 2010年第10期7卷 36-38页

作者：赵鸿北京双鹭药业股份有限公司北京100041

目的:摸索改进的结晶紫染色法与噻唑蓝(MTT)比色法中哪一种方法能够提高干扰素的生物学活性测定(细胞病变抑制法)结果的准确性。方法:比较在干扰素的生物学活性测定后期,采用先结晶紫染色乙醇脱色然后比色的方法(方法一)和采用加入MTT... 详细信息

目的:摸索改进的结晶紫染色法与噻唑蓝(MTT)比色法中哪一种方法能够提高干扰素的生物学活性测定(细胞病变抑制法)结果的准确性。方法:比较在干扰素的生物学活性测定后期,采用先结晶紫染色乙醇脱色然后比色的方法(方法一)和采用加入MTT后裂解比色的方法(方法二),经过多次比较证明哪一种方法测定结果的准确性更高。结果:采用方法二测得的多次结果之间产生的偏差较小,单次结果的可信度较高,单次测定结果的相关系数r值较大。结论:采用MTT比色法比改进的结晶紫染色法更适合应用于干扰素的生物学活性测定,可提高结果的准确性。

关键词：干扰素生物活性结晶紫染色法 MTT比色法 wish细胞

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二丁基锡对人羊膜细胞DNA的损伤作用

海峡预防医学杂志 2016年第3期22卷 68-70页

作者：林春芳黄佳宁福建省疾病预防控制中心福州350001

目的研究二丁基锡(DBT)对人羊膜细胞wish株细胞核DNA的损伤作用。方法用不同浓度的DBT(0、0.031 2、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8μmol/L),分别处理wish细胞2h和24h,用MTT试验计算IC50;根据MTT结果设计彗星试验的浓度(2h:0.06... 详细信息

目的研究二丁基锡(DBT)对人羊膜细胞wish株细胞核DNA的损伤作用。方法用不同浓度的DBT(0、0.031 2、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8μmol/L),分别处理wish细胞2h和24h,用MTT试验计算IC50;根据MTT结果设计彗星试验的浓度(2h:0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0μmol/L;24h:0.003 9、0.007 8、0.015 6、0.031 2、0.062 5μmol/L),并设空白对照,检测DBT对wish细胞DNA的损伤。结果 DBT对wish细胞的2h和24h的IC50分别为3.424和0.463μmol/L。彗星试验中2h处理随着处理浓度升高,wish细胞的彗星尾长增加(0.5、1.0μmol/L),尾部DNA%也增加,呈良好剂量-反应关系;24h处理仅0.062 5μmol/L组彗星尾长与对照组有统计学差异,0.007 8、0.015 6、0.031 2、0.062 5μmol/L组彗星尾部DNA%均高于对照组。结论 DBT可引起wish细胞的DNA损伤。

关键词：二丁基锡 wish细胞 DNA损伤

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中药黄芪抗病毒作用

科学中国人 2015年第5Z期 82-页

作者：周丽红周丽周莉微长春生物制品研究所有限责任公司

中药黄芪能抑制水泡性口炎病毒(VSV)和单纯疱疹I型病毒(HSV-1)。实验证明不同浓度的黄芪对不同的病毒作用结果不同,VSV病毒的抑制效价高于HSV-1病毒的抑制效价,黄芪的浓度越高,对病毒的抑制效果越好。

关键词：中药黄芪病毒(VSV,HSV-1) wish细胞微量细胞病变法