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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2007年第4期35卷 23-26,31页

作者：乔宪凤唐青海郑新民熊忠良刘西梅华文君周荆荣何维明湖北省农业科学院畜牧兽医研究所湖北省动物胚胎工程及分子育种重点实验室湖北武汉430064 西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100

以日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)whe株的基因组RNA为模板,采用RT-PCR技术,克隆了JEV whe株的NS1基因,并对其进行了测序和序列分析。构建了pET28b-NS1表达载体,转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),并对其进行了诱导表达,对... 详细信息

以日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)whe株的基因组RNA为模板,采用RT-PCR技术,克隆了JEV whe株的NS1基因,并对其进行了测序和序列分析。构建了pET28b-NS1表达载体,转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),并对其进行了诱导表达,对表达产物进行检测。结果表明,NS1基因全长1 145 bp,其核酸序列与JEV P3株同源性为99．4％,与SA14和SA14-14-2等27个JEV毒株的核苷酸序列同源性为98％,表明NS1基因的保守性很高;pET28b-NS1表达产物的相对分子质量约为43 ku,大小与预期结果相符。NS1基因克隆表达成功。

关键词：日本脑炎 whe株 NS1基因 RT-PCR

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日本脑炎病毒whe株基因组特征及其疫苗的研究

日本脑炎病毒WHe株基因组特征及其疫苗的研究

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作者：唐青海西北农林科技大学

学位级别：硕士

日本脑炎（Japanese Encephalitis,JE）,又称流行性乙型脑炎,是由日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）引起的一种中枢神经系统人畜共患急性传染病。其致死率高达30%左右,50%的患者会留下永久性的后遗症,其中,中国的JE发病... 详细信息

日本脑炎（Japanese Encephalitis,JE）,又称流行性乙型脑炎,是由日本脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）引起的一种中枢神经系统人畜共患急性传染病。其致死率高达30%左右,50%的患者会留下永久性的后遗症,其中,中国的JE发病数占世界总发病数的80%以上。库蚊伊蚊是该病的主要传播媒介,而猪则是重要的传染源和放大器。猪患JE的主要表现为怀孕母猪流产、产死胎、弱仔、公猪睾丸炎及少数仔猪呈神经症状,给养猪业造成了巨大的经济损失。目前,用于JE免疫预防的疫苗有灭活疫苗和弱毒疫苗两种,其安全性和较高的生产应用成本已成为人们日益关注的问题。近年来,病毒分子生物学和反向遗传学的发展为开发新型JE疫苗提供了新的技术手段。本研究为进一步探索JEV/whe株基因组功能、致病机理及构建高效新型疫苗,开展了以下工作: 1.JEV/whe株全基因组特征分析本研究设计了11对特异性引物,采用RT-PCR技术扩增得到覆盖JEV/whe株基因组全长cDNA的11个特异性片段,测序分析表明,JEV/whe株基因组由一个开放阅读框（ORF,10296个核苷酸）和5’端非编码区（5’LITR,95个核苷酸）和3’端非编码区（3’UTR,585个核苷酸）组成。核苷酸序列和氨基酸序列分析表明,whe株与P3株亲缘关系最近,但3’UTR.形成的二级结构与Vellore P20778株3’UTR.形成的二级结构最相似;与黄病毒科其他属成员比较,3’UTR最末端约84个核苷酸所形成的二级结构相当保守。 whe株与P3株的膜蛋白（E）拥有M（76）、G（306）和L（408）三个特有氨基酸,而在其它19株JEV为T（76）、E（306）、S（408）,推测可能与病毒的宿主及组织嗜性有关。whe株E蛋白中存在控制黄病毒毒力的RGD（387-389）基序,而一部分弱毒株也有该基序,提示JVE毒力型的决定簇具有毒株特异性。由全基因组序列构建的系统发育图与由E基因构建的系统发育图仅有一些细微的差别,表明E基因在研究各分离株之间进化关系中具有重要意义;从GenBank中调出不同时间和地区分离的140株JEV E基因,构建了系统发育图谱。 2.JEV/whe株全长cDNA的长链RT-PCR法扩增采用长链RT-PCR技术扩增基因组全长eDNA。对其进行PCR扩增鉴定,并对含复杂二级结构的3’末端和5’末端非编码区扩增片段进行了测序分析。扩增结果表明,扩增出的JEV whe株基因组全长cDNA分子近11kb大小:非编码区测序分析表明,扩增产物为whe株所特有。证明长链RT-PCR法可用于JEV W-He株基因组全长cDNA的扩增。 3.JEV/whe株DNA疫苗载体构建采用RT-PCR.技术扩增prM/E和NSl全基因并进行序列分析,将其分别克隆于真核表达载体pAVXI.,构建的表达载体pAVXlprM/E和pAVXl-NSl,酶切鉴定和序列分析表明,JEV/whe株DNA疫苗载体构建成功。 4.WIte株NSl基因在大肠杆菌中的表达. 将NSl基因克隆到pET28b（+）表达载体,构建了pET28b（+）.NSl重组表达载体,转化表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）,并对其进行了诱导表达,对表达产物进行检测。结果表明,表达产物相对分子质量约为43ku。为JE亚单位疫苗和DNA疫苗的开发奠定了基础。

关键词：日本脑炎病毒 whe株全长eDNA 疫苗

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