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Virome identification in wheat in the Czech Republic using small RNA deep sequencing

Journal of Integrative Agriculture 2020年第7期19卷 1825-1833页

作者： Khushwant SINGH Jana JAROSOVA Jan FOUSEK CHEN Huan Jiban Kumar KUNDU Plant Virus and Vector Interactions Group Division of Crop Protection and Plant HeatthCrop Research InstitutePrague 16106Czech Republic Zhejiang Tianke High-Technology Development Co. Ltd.Hangzhou 310012P.R.China

High-throughput deep-sequencing technology and bioinformatics analysis of the small RNA(sRNA)population isolated from plants allows universal virus detection and complete virome reconstruction for a given *** the present sRNA deep-sequencing analysis of virus-infected wheat samples in the Czech Republic,samples were firstly tested for barley yellow dwarf viruses(BYDVs),wheat streak mosaic virus(WSMV)and wheat dwarf virus(wdv)using ELISA,RT-PCR and *** sRNA sequencing of these samples yielded more than^60 million single-end 50-bp reads with high confidence for nine field samples of ***,16.5%of reads were virus-specific and 83.5%were mapped to the *** 21-nt reads(-7.7E+06 reads)were found than 24-nt(~6.20E+06 reads)or 22-nt(-4.30E+06 reads)*** novo assembly of the high-quality contigs revealed the presence of three earlier repoted viruses in the Czech Republic:BYDVs(31.48%),WSMV(24.23%)and wdv(2666%).We also showed the presence of cereal yellow dwarf virus(14.33%;two species CYDV-RPS and CYDV-RPV family Luteoviridae/Polerovirus)and wheat yellow dwarf virus(WYDV,3.30%;Luteoviridae).Phylogenetic analysis showed CYDV and WYDV grouped separately from ***,several recombination breakpoints were found among the groups of yellow dwarf viruses(BYDVs,CYDV,and WYDV).Using RNA deep sequencing,we confirmed the presence of the three known viruses(BYDVs,WSMV,and wdv)and the first record of two species of CYDV and WYDV in wheat in the Czech Republic.

关键词： NGS sRNA BYDVs CYDV WSMV WYDV wdv

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小麦矮缩病毒实时荧光定量PCR体系在小麦和异沙叶蝉中的建立与应用

小麦矮缩病毒实时荧光定量PCR体系在小麦和异沙叶蝉中的建立与应用

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作者：尚晓楠中国农业科学院

学位级别：硕士

小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus, wdv)属于联体病毒科玉米线条病毒属,通过异沙叶蝉(Psammotettix striatus L.)介体以持久循回性方式传播,小麦矮缩病害的发生与传播与wdv、异沙叶蝉介体以及小麦寄主之间的互作息息相关。这种互作涉及... 详细信息

小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus, wdv)属于联体病毒科玉米线条病毒属,通过异沙叶蝉(Psammotettix striatus L.)介体以持久循回性方式传播,小麦矮缩病害的发生与传播与wdv、异沙叶蝉介体以及小麦寄主之间的互作息息相关。这种互作涉及三者相关基因的表达。已有研究表明,联体病毒科的病毒粒子在植物细胞间的运输需要病毒的衣壳蛋白(Coat Protein, CP),它辅助运动蛋白(Movement Protein, MP)调控胞间连丝的转运能力,同时,wdv的CP蛋白参与wdv与异沙叶蝉之间的互作。为准确、相对定量地分析wdv相关基因在小麦和介体的表达,本实验分别构建了wdv在小麦和异沙叶蝉体内的RT-qPCR体系。(1)选择小麦的5个持家基因TEF-1-α、GAPDH、18SrRNA、UBC和28SrRNA作为内参基因,以3种统计分析软件Genorm、NormFinder和Bestkeeper分析内参基因在小麦茎和叶两种组织中的表达稳定性。小麦茎中,TEF-1-α最稳定,而28SrRNA最不稳定。小麦叶中,由于三种软件结果不一致,很难确定最稳定和最不稳定的内参基因。但是,小麦茎、叶中最稳定的内参基因组合都是TEF-1-α和GAPDH。同时,由Genorm软件计算内参基因之间的配对变异Vn/Vn+1,判断茎和叶组织中用于标准化的最优内参基因数目至少5个。(2)利用建立好的体系检测了wdv-CP基因在小麦茎、叶两种组织中的相对表达量,结果显示wdv-CP基因在小麦茎中的表达量普遍高于小麦叶,这可能与wdv病毒粒体通过异沙叶蝉进入植物韧皮部组织,韧皮部的运输方向为由植物顶端向根部运输,因此有大量的wdv病毒粒体存在于茎部。(3)首次克隆并测序了异沙叶蝉6个持家基因RPS23e、UBC、Beta-TUB、GAPDH、18SrRNA和ACT2。以这6个持家基因为内参基因,构建了RT-qPCR相对定量体系并利用Genorm、 NormFinder和Bestkeeper软件分析这6个内参基因的稳定性,三个软件分析后均指出RPS23e最稳定,ACT2最不稳定,Beta-TUB和UBC是最稳定的组合。Genorm软件计算出用于标准化的最优内参基因数目至少6个。(4)利用构建的体系分析了不同取食时间点(12 h-156 h,每隔12 h为一个时间点)wdv-CP基因在异沙叶蝉中表达量的趋势：12 h-48 h递减,48 h-96 h开始增加,96 h达到最高,96 h-120 h递减,120 h-156 h再一次递增。昆虫体内病毒表达量下降可能是存在唾液腺的病毒粒体由介体口器进入植物韧皮部,而后出现上升是由于持久循回性病毒传播的病毒只能局限在植物韧皮部中复制,当叶蝉继续吸食韧皮部,韧皮部中的病毒粒体再次进入介体体内。如此反复,wdv-CP基因的表达量在异沙叶蝉体内为一个动态平衡。综述所述,利用构建的RT-qPCR体系可以成功检测wdv在小麦和异沙叶蝉体内表达量的变化,有助于研究wdv与小麦和介体之间的互作。

关键词： wdv RT-qPCR 小麦异沙叶蝉

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