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流式细胞术检测vpr蛋白对细胞周期影响实验

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实验技术与管理 2010年第6期27卷 33-36页

作者：王小利杨怡姝孙晓娜肖向茜沈思嗣北京工业大学生命科学与生物工程学院

流式细胞术是生物学领域重要的检测技术。为实现实验教学与科研工作的紧密结合,该设计采用流式细胞仪检测表达绿色荧光蛋白阳性细胞比例和细胞周期分布,分析质粒转染的效率并研究蛋白的功能。通过2个经典的检测方案,使学生更好地理解和... 详细信息

流式细胞术是生物学领域重要的检测技术。为实现实验教学与科研工作的紧密结合,该设计采用流式细胞仪检测表达绿色荧光蛋白阳性细胞比例和细胞周期分布,分析质粒转染的效率并研究蛋白的功能。通过2个经典的检测方案,使学生更好地理解和掌握流式细胞术的检测原理、操作步骤及结果分析方法。

关键词：流式细胞术绿色荧光蛋白 vpr蛋白细胞周期

HAD和非HAD病人来源的HIV-1 vpr蛋白对小鼠神经瘤母细胞N2a细胞周期及凋亡的影响

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HAD和非HAD病人来源的HIV-1 Vpr蛋白对小鼠神经瘤母细胞N2a细胞周...

作者：曹馨月山东大学

学位级别：硕士

目的:HIV相关性痴呆（HIV associated dementia,HAD）是HIV-1感染者重要的神经系统并发症,患者症状包括记忆障碍,精神运动迟缓,注意力丧失,冷漠以及认知障碍。随着病情的加重,晚期会发生严重痴呆,昏迷和瘫痪。随着全球范围内高效抗反转... 详细信息

目的:HIV相关性痴呆（HIV associated dementia,HAD）是HIV-1感染者重要的神经系统并发症,患者症状包括记忆障碍,精神运动迟缓,注意力丧失,冷漠以及认知障碍。随着病情的加重,晚期会发生严重痴呆,昏迷和瘫痪。随着全球范围内高效抗反转录病毒疗法的广泛使用,一方面提高了 HIV患者的生存时间和生活质量,另一方面又使得艾滋病逐渐成为一种慢性病,从而增加了 AIDS相关的慢性神经系统并发症的发病率。目前研究认为HAD的发病机制与患者大脑神经细胞的损伤和凋亡有关,且其病情的发生和发展也与HIV-1的神经致病性以及患者免疫水平相关。HIV-1侵犯中枢神经系统（central nervous system,CNS）后,由于自身高变异特性和CNS独特的生理环境,造成了病毒在中枢与外周不同的变异情况。vpr蛋白是HIV-1的辅助蛋白,可以通过与细胞内多种蛋白间复杂的互相作用,影响到宿主基因的表达,诱导神经细胞G2期停滞,并可以通过直接或者间接的方式导致神经细胞发生凋亡,是诱导HAD发生及发展的重要因素之一。为了探究HIV-1的vpr基因序列在患者中枢和外周的变异情况,以及vpr基因变异导致的氨基酸位点的变化致vpr蛋白生物学活性的改变与HAD的关系,本文研究了一例HAD和一例非HAD患者中枢和外周HIV-lvpr基因序列变异,并构建了不同来源的vpr真核表达载体,探讨vpr蛋白对小鼠神经瘤母细胞N2a细胞活性、周期阻滞和凋亡的影响及其作用机制,以期为HAD的致病机制提供新的思路。方法:***-1 vpr基因克隆及序列分析（1）HIV-1 vpr基因克隆以一例HAD病人（H）与一例非HAD病人（N）外周部位的淋巴结（lymphnode,LN）、脾脏（spleen,SPL）、肝脏（liver,LIV）和中枢神经系统的颞叶皮质（temporal cortex,TC）、脑膜（meninges,MG）、额叶白质（white matter from frontal cortex,WM）、基底核（basal ganglia,BG）共十四个部位的尸检标本基因组DNA为模板,通过巢式PCR技术扩增HIV-1 vpr基因序列,并将扩增的目的基因连接到pMD19-T克隆载体上,转化进大肠杆菌感受态中,通过氨苄青霉素和蓝白斑试验筛选出阳性菌落（每个部位各5个）测序验证。（2）HIV-1 vpr序列分析利用MEGA和Bioedit等生物学软件对测序成功的序列绘制系统进化树、计算基因距离和同义/非同义替换值以及分析氨基酸突变位点。***-1 vpr蛋白对神经细胞活性、周期阻滞和凋亡的影响（1）pEGFP-N1-vpr真核表达载体的构建根据测序结果选取中枢和外周变异较大的四个vpr基因片段（H-MG、H-SPL、N-MG、N-SPL）为模板,PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳回收,并通过限制性核酸内切酶Xho Ⅰ和HindⅢ将目的基因与pEGFP-N1载体分别双酶切,回收产物,16℃连接过夜,将连接产物转化进大肠杆菌DH5 α感受态细胞中,接种于含有氨苄青霉素的LB固体培养基,37℃培养16～18h后,提取重组质粒测序鉴定。（2）HIV-1 vpr在N2a细胞中的表达及鉴定将真核表达载体pEGFP-N1-vpr转染N2a细胞,细胞对照组和空载体对照组分别为正常细胞组和pEGFP-N1空载体组。在荧光显微镜下观测,追踪,记录不同时间点绿色荧光蛋白的表达量来初步判断HIV-1 vpr蛋白的表达情况,通过Western blot鉴定HIV-1 vpr在N2a细胞中的表达。（3）HIV-1 vpr蛋白对小鼠神经瘤母细胞N2a细胞活性、周期阻滞和凋亡的影响转染48h后,采用CCK8试剂盒检测vpr蛋白对N2a细胞活性的影响;采用流式细胞仪PI单标法分析HIV-1 vpr蛋白对N2a细胞周期的影响,实验结果通过modfit软件处理;采用流式细胞仪Annexin V-7-AAD/PE双标法检测不同来源的vpr蛋白对N2a细胞凋亡率的影响。3.统计学分析数据分析采用SPSS 18.0软件包。基因距离比较采用两两比较的t检验;各组N2a细胞活性、周期阻滞率和凋亡率的比较采用完全随机的单因素方差分析,若数据满足正态及方差齐,则组间比较采用LSD法;若数据满足正态但是方差不齐,则采用welch校正,组间比较采用Dunnett’s T3法。计量资料以（?）±S表示,P=0.05。结果:***-1 vpr基因多态性及氨基酸序列分析（1）HIV-1 vpr基因克隆巢式PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后,均在300bp处显示出明显条带,与预计（288bp）相符。测序后经BLAST鉴定为HIV-1 B亚型vpr基因序列。（2）HIV-1 vpr系统进化树

关键词： HIV-1 vpr蛋白 HIV相关性痴呆 G2周期阻滞细胞凋亡

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HIV vpr蛋白诱导细胞凋亡研究进展

中国生物工程杂志 2003年第9期23卷 6-10页

作者：魏强王健伟李凡洪涛吉林大学基础医学院吉林130021 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京100052

vpr蛋白是HIV的一个辅助蛋白 ,可以诱导多种细胞的凋亡。目前的研究表明vpr蛋白引起细胞凋亡主要是通过线粒体途径实现的。vpr蛋白通过直接而且特异地与结合在PTPC中的ANT相互作用 ,改变线粒体膜通透性 ,导致凋亡诱导因子 (AIF)和细胞色... 详细信息

vpr蛋白是HIV的一个辅助蛋白 ,可以诱导多种细胞的凋亡。目前的研究表明vpr蛋白引起细胞凋亡主要是通过线粒体途径实现的。vpr蛋白通过直接而且特异地与结合在PTPC中的ANT相互作用 ,改变线粒体膜通透性 ,导致凋亡诱导因子 (AIF)和细胞色素C的释放 ,激活Caspase、DNases等的级联反应 ,引起核染色质的固缩 ,最终引起细胞凋亡。

关键词：人类免疫缺陷病毒 HIV vpr蛋白细胞凋亡线粒体

人类免疫缺陷病毒（HIV）vpr蛋白的研究进展

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山东预防医学 1997年第3期17卷 150-152页

作者：董少忠胡方中国医学科学院

Ｖｐｒ蛋白对ＨＩＶ在细胞中复制的速率有加速作用，其定位于病毒颗粒中，能同细胞核基质结合，并与细胞内的蛋白发生相互作用，影响细胞功能，对深入研究ＨＩＶ的感染过程有重要意义。

关键词：艾滋病毒 vpr蛋白研究进展

HIV vpr蛋白与细胞凋亡的关系及其作用

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国际流行病学传染病学杂志 2006年第6期33卷 379-382,398,405页

作者：丁佩佩郑煜煌谌资刘猛刘纯江门市中心医院感染科 529030 中南大学湘雅二医院艾滋病研究室长沙410011

vpr基因是HIV的辅助基因之一,编码一个96氨基酸的vpr辅助蛋白。在病毒侵犯宿主细胞的过程中,vpr蛋白发挥着重要的作用。它参与病毒整合前复合体的核转运,激活病毒的转录过程,诱导感染细胞周期的G2/M期停滞,促进感染细胞凋亡。这些生物... 详细信息

vpr基因是HIV的辅助基因之一,编码一个96氨基酸的vpr辅助蛋白。在病毒侵犯宿主细胞的过程中,vpr蛋白发挥着重要的作用。它参与病毒整合前复合体的核转运,激活病毒的转录过程,诱导感染细胞周期的G2/M期停滞,促进感染细胞凋亡。这些生物活性提示vpr能与感染细胞内的生化路径相互作用,调节HIV-1的复制和发病。vpr有多种作用,其中促细胞凋亡活性受vpr基因变异位点的影响,如单个的L64P的变异就能显著增强其活性。vpr部分或完全缺陷与感染者病程进展缓慢有关。vpr主要通过线粒体及caspase途径诱导细胞凋亡,但目前vpr在疾病的发病及进展过程的作用尚未完全弄清。本文主要讨论vpr基因在病毒感染过程中的作用,尤其是诱导细胞凋亡的作用以及对将来通过抑制vpr来抗病毒治疗的展望。

关键词：肿凋亡 G2/M滞留核转运 vpr蛋白基因

HIV vpr蛋白诱导细胞凋亡的线粒体途径研究进展

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包头医学院学报 2006年第4期22卷 463-465页

作者：柴勇刘丹如包头市第四医院皮肤科内蒙古包头014030 山东医学科学院

艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是由于机体感染了人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)而导致免疫功能缺陷,并发机会性肿瘤和感染.HIV基因组主要由gag、pol、env基因组成,此外还包括6个辅助性基因:tat、... 详细信息

关键词： vpr蛋白 HIV-1 诱导细胞凋亡线粒体途径人免疫缺陷病毒类固醇激素受体免疫功能缺陷基因组成

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人类免疫缺陷病毒vpr蛋白研究进展

医学研究杂志 1998年第10期32卷 18-20页

作者：董少忠胡方中国医学科学院/中国协和医科大学医学生物学研究所昆明650107

vpr蛋白对HIV在细胞中复制的速率有加速作用。其定位于病毒颗粒中,能同细胞核基质结合,并与细胞内的蛋白发生相互作用,影响细胞功能。

关键词：人类免疫缺陷病毒 vpr蛋白

HIV-1病毒蛋白R的神经毒性作用研究进展

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中华实验和临床病毒学杂志 2019年第3期33卷 323-326页

作者：曹馨月赵丽山东大学公共卫生学院微生物检验学系山东省“十三五”高校重点实验室感染性疾病防控重点实验室济南 250012

HIV-1病毒蛋白R( Viral Protein R,vpr)是HIV?1的辅助蛋白,可以增加HIV-1的感染性,激活潜伏期病毒,并可以协同其他辅助蛋白的功能。多项研究已经证明了 vpr在HIV-1相关神经系统疾病发病机制中的重要作用,vpr可以破坏血脑屏障的完整性,... 详细信息

HIV-1病毒蛋白R( Viral Protein R,vpr)是HIV?1的辅助蛋白,可以增加HIV-1的感染性,激活潜伏期病毒,并可以协同其他辅助蛋白的功能。多项研究已经证明了 vpr在HIV-1相关神经系统疾病发病机制中的重要作用,vpr可以破坏血脑屏障的完整性,诱导神经细胞凋亡,并且可能是艾滋病痴呆综合征(AIDS dementia complex, ADC)发生和发展的重要致病因子,但是其确切机制仍然不详,本文主要就HIV-1 vpr蛋白的神经毒性作用作一综述。

关键词： HIV-1 vpr蛋白神经致病性

HIV-1附属蛋白在HIV-1/HCV共感染中的作用及研究进展

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中国艾滋病性病 2020年第9期26卷 1021-1024页

作者：周正萍黄文昶邹薇南昌大学南昌330006 南昌大学第一附属医院南昌330006

当前,全世界丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染病例人数已从1.7亿增加到1.85亿。同时,大约有400万~500万的HCV感染病例感染了艾滋病病毒(HIV)。许多研究发现,HIV-1/HCV共感染患者中的HIV-1可以通过多种途径加速HCV感染的进程,从而增加肝纤维化... 详细信息

当前,全世界丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染病例人数已从1.7亿增加到1.85亿。同时,大约有400万~500万的HCV感染病例感染了艾滋病病毒(HIV)。许多研究发现,HIV-1/HCV共感染患者中的HIV-1可以通过多种途径加速HCV感染的进程,从而增加肝纤维化和肝癌的风险。最重要的是,共感染中HIV-1的6个附属蛋白:Tat,Rev,Vif,vpr,Vpu和Nef,在促进病毒增殖、诱导免疫抑制和细胞死亡中起着重要作用。本文着重于阐述HIV-1的6个附属蛋白在HIV-1/HCV共感染的发病机理中的作用。

关键词： 1型艾滋病病毒/丙型肝炎病毒 Tat蛋白 Rev蛋白 Vif蛋白 vpr蛋白 Vpu蛋白 Nef蛋白