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牛布鲁氏菌virb12蛋白的抗原表位生物信息学分析与原核表达

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黑龙江畜牧兽医 2023年第19期 72-81,140页

作者：徐赵玉任立松岳海涛杨洁新疆大学生命科学与技术学院乌鲁木齐830046 天康生物股份有限公司乌鲁木齐830011

为了获得高纯度牛布鲁氏菌virb12蛋白及其抗原表位蛋白VB-BW,试验采用生物信息学方法对牛布鲁氏菌virb12蛋白的理化性质、空间结构、信号肽、结构域、跨膜结构、磷酸化位点、抗原表位等进行预测,在此基础上设计抗原表位蛋白VB-BW;virb12... 详细信息

为了获得高纯度牛布鲁氏菌virb12蛋白及其抗原表位蛋白VB-BW,试验采用生物信息学方法对牛布鲁氏菌virb12蛋白的理化性质、空间结构、信号肽、结构域、跨膜结构、磷酸化位点、抗原表位等进行预测,在此基础上设计抗原表位蛋白VB-BW;virb12与VB-BW基因经PCR扩增后与pGEX4T-1载体连接,并转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达蛋白;经His-Trap HP亲和纯化后对virb12与VB-BW蛋白进行SDS-PAGE分析与Western-blot鉴定。结果表明:virb12蛋白由172个氨基酸组成,理论等电点为10.28,脂肪族氨基酸占比较高,半衰期大于10 h;α-螺旋、β-转角、β-折叠与无规则卷曲结构占总蛋白的比例分别为38.95%、4.07%、13.95%与43.02%;含有15个氨基酸组成LIPO型信号肽与一个OmpA同源区域;无跨膜结构;有13个磷酸化位点;含有7个优势B淋巴细胞抗原表位与4个优势T淋巴细胞抗原表位;设计出的抗原表位蛋白VB-BW共有79个氨基酸,由virb12蛋白的第67~97位与第130~172位氨基酸经刚性连接子连接组成。扩增出的virb12与VB-BW基因大小为561 bp与270 bp;重组表达载体BL21-VB和BL21-BW在诱导剂IPTG浓度为0.2 mmol/L、诱导时间为10小时时表达出的virb12与VB-BW蛋白含量最高,经纯化后最终获得大小为47.7 ku与36.3 ku的virb12与VB-BW蛋白。说明试验构建出表达virb12与VB-BW蛋白的原核表达体系。

关键词： virb12蛋白生物信息学抗原表位原核表达亲和层析

布鲁氏菌virb12蛋白纯化及其抗体ELISA方法的初步建立

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沈阳农业大学学报 2019年第2期50卷 154-160页

作者：张婷婷刘梦志冯生杨江花叶银波陈泽良沈国顺刘宝山沈阳农业大学畜牧兽医学院沈阳110161

为获得高纯度布鲁氏菌virb12蛋白,对virb12分泌表达蛋白先后进行亲和纯化和离子交换纯化。将其作为抗原包被ELISA板,优化反应条件后初步建立了布鲁氏菌抗体的ELISA检测方法。结果表明:蛋白纯化效果良好,重组蛋白纯度可达到98%以上。在... 详细信息

为获得高纯度布鲁氏菌virb12蛋白,对virb12分泌表达蛋白先后进行亲和纯化和离子交换纯化。将其作为抗原包被ELISA板,优化反应条件后初步建立了布鲁氏菌抗体的ELISA检测方法。结果表明:蛋白纯化效果良好,重组蛋白纯度可达到98%以上。在建立的ELISA中,纯化重组蛋白的最佳包被浓度为1μg·mL-1,最适封闭剂为5%脱脂奶粉,血清最佳稀释浓度为1∶25,酶标二抗最佳工作浓度为1∶1500。对20份阳性血清及12份阴性血清的检测结果表明,其与SUANOVIR Brucella-Ab C-ELISA试剂盒的总体符合率达到90.6%,表明本试验建立的以virb12重组蛋白为抗原的ELISA方法可以检测布氏杆菌感染抗体,有望研制成试剂盒用于养殖场布病的检测和净化。

关键词：布鲁氏菌 virb12蛋白纯化 ELISA

应用virb12蛋白建立检测牛布鲁菌血清抗体的方法

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中国兽医学报 2013年第3期33卷 400-403页

作者：王冲孙勇戚帅宋砚泽田武林崔敏薛雨佳张西臣闫广谋吉林大学动物医学学院吉林长春130062

从牛布鲁菌基因组中克隆出virb12基因,以pET-28α(+)为模板构建virb12原核表达载体pET-V12,pET-V12在E.coli BL21(DE3)中表达重组virb12蛋白。经Western-blotting分析,表明重组的virb12蛋白具有免疫原性。以纯化的virb12蛋白为抗原,建立了间接ELISA检测牛布鲁菌抗体的方法。经对300份牛血清样品间接ELISA与虎红平板试验(RBPT)检测结果的比较,该方法的敏感性为89%,特异性为98.3%,准确度为92.7%。

关键词：牛布鲁菌 virb12蛋白原核表达间接ELISA

virb12基因缺失马耳他型布氏杆菌M5-90疫苗株的研究

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virB12基因缺失马耳他型布氏杆菌M5-90疫苗株的研究

作者：高宇哲中国农业科学院

学位级别：硕士

布氏杆菌病是五种世界范围内由细菌引起的传染性人兽共患疾病之一,布氏杆菌为革兰氏阴性,无芽孢,兼性厌氧的胞内寄生菌,分为7个种:Brucella melitensis（羊种）, Brucella suis（猪种）, Brucella abortus （牛种）, Brucella ovis（绵... 详细信息

布氏杆菌病是五种世界范围内由细菌引起的传染性人兽共患疾病之一,布氏杆菌为革兰氏阴性,无芽孢,兼性厌氧的胞内寄生菌,分为7个种:Brucella melitensis（羊种）, Brucella suis（猪种）, Brucella abortus （牛种）, Brucella ovis（绵羊种）, Brucella canis （犬种）, Brucella neotomae （沙田鼠种）,以及Brucella maris（海洋种）。造成公共卫生危害的主要是羊种、牛种和猪种布氏杆菌,其中以羊种危害最为严重。血清学监测对动物布氏杆菌病的防控和净化具有极为重要的意义。我国目前应用的布氏杆菌疫苗株包括羊种的M5-90,牛种的A19和猪种的S2。这三种疫苗都存在着疫苗免疫反应与自然感染无法区别的问题,对布病防控带来极大的困扰,迫切需要研发新型标记疫苗。 virb12基因是布氏杆菌IV型分泌系统中的编码基因之一,而IV型分泌系统已被证明是布氏杆菌主要的毒力因子,有研究表明virb12蛋白位于布氏杆菌细胞表面,并可能在侵染宿主细胞时起重要作用。相关研究表明virb12蛋白能够诱导宿主产生相应抗体,是具有实际应用价值的布氏杆菌病血清学诊断靶抗原。M5-90疫苗株是将羊种M5疫苗株在鸡成纤维细胞上传代90次之后而得到的毒力减弱的疫苗株,在我国得到广泛应用于牛羊的布氏杆菌病防控,其安全性和有效性已经为实践证明。对M5-90疫苗株的virb12基因进行人工缺失,有望获得能够鉴别自然感染和疫苗免疫反应的标记疫苗。为此,本研究首先利用大肠杆菌重组表达了virb12蛋白,作为检测抗原,建立了检测相应抗原的间接ELISA方法。利用该方法检测了60份布氏杆菌阳性山羊血清及30份布氏杆菌阴性山羊血清,检出符合率为91.7%,证明重组virb12蛋白对山羊布氏杆菌病的检测具有良好的特异性和敏感性。进一步采用基因组同源重组方法,构建了virb12基因缺失的M5-90疫苗株（M5-90-virb12）。BALB/c小鼠的毒力残留试验结果显示,M5-90-virb12与M5-90免疫小鼠的脾脏重量与荷菌量的消减趋势基本吻合,表明M5-90-virb12与M5-90的生物安全性没有显著差别。BALB/c小鼠进行的攻毒保护实验结果显示,攻毒后M5-90-virb12和M5-90免疫鼠之间的脾脏重量及荷菌量均无显著差异,且与对照组差异显著。同时在一个月之内监测了M5-90以及M5-90-virb12诱导羊产生的抗体水平,两者无明显差异。说明缺失株M5-90-virb12保持了M5-90疫苗的免疫保护效力。综上,本研究验证了virb12蛋白可以作为布氏杆菌的一种血清学标记,并为布氏杆菌标记疫苗的构建提供了一个新的候选基因。

关键词： virb12基因 virb12蛋白布氏杆菌标记疫苗布氏杆菌检测