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Bt杀虫基因vip3a（a）转化芽孢杆菌TB2的研究

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Bt杀虫基因vip3A（a）转化芽孢杆菌TB2的研究

作者：洪鹏翔福建农林大学

学位级别：硕士

根据GenBank上登录的Bacillus subtilis *** str．168(简称BS168)序列(NC000964)，设计出包含两种不同限制性内切酶位点的1对扩增rpsD启动子序列的特异引物RpsF／RpsR，用PCR方法从BS168的总DNA中扩增出rpsD启动子基因，命名为rpsP。并... 详细信息

根据GenBank上登录的Bacillus subtilis *** str．168(简称BS168)序列(NC000964)，设计出包含两种不同限制性内切酶位点的1对扩增rpsD启动子序列的特异引物RpsF／RpsR，用PCR方法从BS168的总DNA中扩增出rpsD启动子基因，命名为rpsP。并根据已经在GenBank上登录的Bt vip3a(a)基因序列，设计出包含两种不同的限制性内切酶位点的1对特异引物vip-F／vip-R，以含有对鳞翅目夜蛾科害虫具有广谱高效杀虫活性基因vip3a(a)的苏云金芽孢杆菌(***，Bt)菌株Bt-WB7的总DNA为模板，用PCR方法扩增出vip3a(a)基因。再将rpsP和vip3a(a)基因的PCR产物分别用NdeⅠ单酶切，之后将两个单酶切产物用T4连接酶连接。以连接产物为模板，用RpsF／vip-R为引物，扩增启动子-vip基因序列，将PCR产物直接连接到pMD-18T克隆载体上转入大肠杆菌(Escherichia coli)JM109。挑取阳性克隆，提取重组质粒pMD-p-vip进行酶切与PCR验证后进行测序。将测序验证正确的启动子-vip基因，用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切从pMD-p-vip重组质粒上切下，回收目的片段与用相同酶切的表达载体Pgfp4412相连，得到重组原核表达质粒pvipgfp。将重组原核表达质粒pvipgfp转化解淀粉链芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)受体菌株TB2中，挑取转化子用PCR检测重组质粒pvipgfp导入情况，最后通过生物测定筛选得到能高效表达Bt vip3a(a)基因的TB2-16工程菌。研究表明TB2-16工程菌株培养液对斜纹夜蛾幼虫的具有很高的毒杀作用;抑菌实验表明TB2-16工程菌株对大豆炭疽病菌、柑橘炭疽病菌、黄瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌5种病原菌的抑制效果与TB2无明显差异，而且菌落形态基本上保持不变;内生和对植物生长影响研究表明TB2-16具有良好的内生和促生特性。

关键词： vip3a 内生工程菌杀虫活性内生定殖抑菌活性

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新型vip3a蛋白抗二化螟机理研究

新型Vip3A蛋白抗二化螟机理研究

作者：刘显波中国农业科学院

学位级别：硕士

营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Proteins,vips)是来自于苏云金芽孢杆菌在营养生长对数中期开始分泌的一类胞外毒素蛋白,是与杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)杀虫作用机制截然不同的第二代新型杀虫蛋白。目... 详细信息

营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Proteins,vips)是来自于苏云金芽孢杆菌在营养生长对数中期开始分泌的一类胞外毒素蛋白,是与杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)杀虫作用机制截然不同的第二代新型杀虫蛋白。目前已利用vip基因构建了转基因水稻等多种转基因作物,但尚未发现具有抗二化螟能力的vip基因的报道,在本实验室前期合作研究中发现一个具有抗二化螟能力的转vip3a基因水稻,该基因暂定名为SBR(Stem Borer Resistance)。按照vip3a蛋白结构及前人研究报道,将vip3a蛋白序列分为1-199氨基酸的N-端,200-533氨基酸的核心区域和534-789氨基酸的C-端。SBR基因由两个vip3a基因vip3aa1和vip3ad2的不同功能域嵌合形成,其蛋白组成包括vip3ad2-N端,vip3ad2核心区域和vip3aa1-C端。本研究利用vip3aa1和vip3ad2的不同功能域嵌合成三个不同的vip3a基因包括SBR、vip3aa Ad1和vip3aa Ad2基因,对5个vip3a基因(vip3aa1、vip3ad2、SBR、vip3aaAd1和vip3aa Ad2)进行抗虫性鉴定分析;通过胰蛋白酶处理分析相应蛋白对于胰蛋白酶的敏感性;再进一步将上述5个vip3a基因两端(N端和C端)分别同红色荧光蛋白rfp基因和绿色荧光蛋白gfp基因从而获得携带标记蛋白的原核表达蛋白和含双色基因的转vip3a基因水稻,通过二化螟喂食实验,以期了解vip3a蛋白在二化螟体内结合部位和作用机理。其主要结果如下:1、构建5个vip3a基因植物表达载体p1300-vip3aa1、p1300-vip3ad2、p1300-SBR、p1300-vip3aaAd1和p1300-vip3aaAd2,通过农杆菌介导法获得转vip3a基因水稻;通过对T0代和T1代转化体材料进行二化螟抗性初步鉴定发现,vip3aa1、SBR、vip3aaAd1和vip3aa Ad2基因表现出高抗二化螟能力,而vip3ad2基因只表现出一般的抗二化螟能力。由于vip3ad2的C末端比vip3aa1的C末端少了3个氨基酸,推测SBR基因抗二化螟能力与来源于vip3aa1基因的C端基因序列密切相关。2、构建了原核表达载体pET28-vip3aa1,pET28-vip3ad2,pET28-SBR,pET28-vip3aaAd1和pET28-vip3aaAd2并诱导获得相应表达蛋白;通过不同浓度的胰蛋白酶处理5个vip3a蛋白,发现胰蛋白酶浓度超过0.1μg/μL时才能消化产生62KDa核心多肽,当胰蛋白酶浓度达1.0μg/μL,vip3ad2蛋白的62KDa核心多肽被消化降解,而vip3aa1、SBR、vip3aaAd1和vip3aa Ad2蛋白的62KDa核心多肽未被消化降解,表明来源于vip3aa1基因的C末端(534-789区域)对于62KDa毒性核心多肽的稳定起到至关重要的作用,该结果进一步验证了SBR基因抗二化螟能力与来源于vip3aa1基因的C端基因序列密切相关。3、构建5个vip3a基因融合gfp和rfp基因的植物表达载体和原核表达载体,利用两种载体分别获得转基因T0代植株和诱导表达出约130KDa的目的融合蛋白;通过胰蛋白酶处理融合蛋白验证发现5个vip3a融合蛋白均能形成62KDa核心多肽,为后续进一步开展抗虫性鉴定和了解vip3a蛋白对二化螟的作用机理奠定基础。

关键词：水稻 vip3a 抗虫二化螟

一种新的对鳞翅目昆虫具有广谱活性的苏云金杆菌杀虫蛋白──vip3a

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昆虫知识 1997年第6期34卷 355-355,354页

作者：翟林中国科学院动物研究所北京100080

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vip3a蛋白诱导昆虫细胞凋亡

Vip3A蛋白诱导昆虫细胞凋亡

苏云金芽孢杆菌新型营养期杀虫蛋白vip3a研究

中国植物保护学会2015年学术年会

作者：姜昆汪婷婷袁宇陈月华蔡峻南开大学微生物学系分子微生物学与技术教育部重点实验室

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）营养期分泌产生的vip3a蛋白与Bt芽胞期产生的杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins,ICPs）没有同源性,尤其他对很多杀虫晶体蛋白不敏感的夜蛾科害虫有特效,因此被誉为第二代杀虫蛋... 详细信息

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）营养期分泌产生的vip3a蛋白与Bt芽胞期产生的杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins,ICPs）没有同源性,尤其他对很多杀虫晶体蛋白不敏感的夜蛾科害虫有特效,因此被誉为第二代杀虫蛋白。随着靶标昆虫对转ICP类杀虫蛋白作物和杀虫制剂的抗性的产生,研发新的、安全有效的杀虫蛋白迫在眉睫。目前的研究显示vip3蛋白与Cry蛋白无论在作用受体和杀虫模式上都有所不同,从而使其备受关注。但vip3a具体的作用机理尚不明确。我们研究发现,在离体条件下,纯化的vip3a蛋白能够与sf9细胞结合,并有效杀死sf9细胞,对sf9细胞的半致死浓度为6.8μg/mL,与国外文献报道基本一致。sf9细胞用vip3a处理12h之后,细胞内有明显的空泡。经vip3aa蛋白处理的sf9细胞Total DNA在琼脂糖凝胶中呈现典型的凋亡细胞DNA的梯状条带。TUNEL staining,Caspase-1酶活分析,annexin V/PI双染后的流式细胞仪检测结果均表明vip3aa蛋白处理的sf9细胞发生了明显的凋亡现象。

关键词：苏云金芽孢杆菌 vip3a sf9细胞细胞凋亡

来源： cnki会议评论

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激光生物学报 2005年第6期14卷 472-476页

作者：刘汉军丁学知李焕发夏立秋湖南师范大学生命科学学院中国湖南长沙410081

营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Protein,vip)vip3a是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在营养生长对数中期分泌产生的一类新型杀虫蛋白。vip3a广泛存在于Bt中,与晶体杀虫蛋白(InsecticidalCrystal Proteins,ICPs)没有任何同源性,不具有多样性,在遗传上比较保守。其N-端存在一趋化信号传导因子相似序列,C-端存在着纤维素结合结构域。vip3a蛋白通过诱发细胞凋亡,最终导致细胞死亡,这与Btδ-内毒素的作用机理完全不同。本文主要对vip3a杀虫蛋白的发现、特性及作用机理作一简要综述。

关键词：苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白 vip3a

营养期杀虫蛋白vip3a与对棉铃虫中肠BBMV结合能力的杀虫活性研究

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营养期杀虫蛋白Vip3A与对棉铃虫中肠BBMV结合能力的杀虫活性研究

In-depth analysis of Bt cotton adoption:farmers'opinions,genetic landscape,and varied perspectives——a case study from Pakistan

中国植物保护学会2009年学术年会

作者：张谦梁革梅中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室

利用现代基因工程技术在棉株中导入Bt基因而选育的Bt棉,因其具有稳定和连续的抗虫效果,被认为是最经济、最有效的害虫防治方法。自1996年转基因棉花在美国商业化种植以来,其种植面积在世界范围内快速增长。中国于1997年开始批准商业化种... 详细信息

利用现代基因工程技术在棉株中导入Bt基因而选育的Bt棉,因其具有稳定和连续的抗虫效果,被认为是最经济、最有效的害虫防治方法。自1996年转基因棉花在美国商业化种植以来,其种植面积在世界范围内快速增长。中国于1997年开始批准商业化种植,到2008年,种植面积达到400万hm,占世界Bt棉花种植面积的26%。但和其他的化学农药一样,随着Bt棉花的广泛种植,靶标害虫也有可能对Bt棉花产生抗性,从而导致Bt棉花失去其利用价值。第一代转基因棉花转入的主要是cry基因,为延缓昆虫对Cry毒素抗性的产生,人们提出了转双基因和新抗虫基因的应用策略,但该策略有效实施的重要前提就是转入的新基因和已产生抗性的基因之间不存在交互抗性。大量研究表明,Bt在营养期会分泌一种和杀虫晶体蛋白完全不一样的杀虫蛋白vips(vegetative insecticidal proteins),其中vip3对多种鳞翅目害虫有很高的杀虫活性,而且vip3毒素和Cry毒素的杀虫机理存在差别,在进化上没有同源性,害虫对这两种毒素产生交互抗性的机率很小。但是vip3a蛋白对鳞翅目的杀虫活性存在很大的区别,例如对小地老虎的活性要比Cry毒素高520多倍,对秋黏虫,美洲棉铃虫,甜菜夜蛾的杀虫活性与Cry毒素没有明显区别,而对欧洲玉米螟没有杀虫活性。所以,明确vip3a毒素对不同靶标害虫的杀虫活性及作用机制至关重要。本研究利用生物测定的方法明确了vip3a毒素对不同品系棉铃虫的杀虫活性,并运用表面等离子体共振技术(Surface Plasmon Resonance,SPR)比较了vip3a毒素与不同品系棉铃虫的BBMV(brush border membrance vesicles)的结合差异。我们选择了在实验室一直筛选的抗性品系和敏感品系作为材料,抗性品系包括单独用Cry1Ac毒蛋白筛选的品系和利用含多种毒素的Bt杀虫剂筛选的品系,并在此基础上,利用抗性品系和亲本的敏感品系进行回交,筛选得到抗性近等基因系,确保试验材料保持相同的遗传背景,使试验的结果更具有可信度。主要结果包括:***3A毒素对3个选定的试验品系均具有杀虫活性,但是在致死中浓度上存在差异。Bt杀虫剂品系>Bt毒蛋白品系>敏感品系,抗性品系的敏感度降低,杀虫剂筛选的品系对vip3a存在更强的适应性,表明在抗性筛选过程中,杀虫剂中含有的vip3类毒素已经使棉铃虫对其产生了相应的选择压力。2.比较了3个近等基因系的中肠液对vip3a毒素的消化情况,同等质量的原毒素与同等的中肠液反应,消化情况存在差异。89kD的原毒素被消化成更小的核心蛋白的反应时间不同,敏感品系最快被消化成核心蛋白以及更小的蛋白,杀虫剂品系最慢,毒蛋白品系居中。因此,推测抗性的产生可能与消化减慢有关。3.利用SPR技术比较了消化前后的vip3a毒素与棉铃虫BBMV的结合情况,结果表明结合能力上也存在差异。未被消化的毒素比消化过的含有核心蛋白的毒素结合BBMV的能力要弱,反映在响应值的数值上大约相差4倍;且3个近等基因系与同类蛋白结合上同样存在的差异,Bt杀虫剂品系>Bt毒蛋白品系>敏感品系。因此,结合能力的变化可能也是抗性产生的原因之一。

关键词： vip3a Bt棉花交互抗性近等基因系棉铃虫 BBMV SPR

来源： cnki会议评论

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Journal of Cotton Research 2024年第3期7卷 277-288页

作者： SHAHZAD Rahil JAMIL Shakra CHAUDHRY Urooj Fatima RAHMAN Sajid Ur IQBAL Muhammad Zaffar Genetically Modified Organisms Development and Testing Laboratory Agricultural Biotechnology Research InstituteAyub Agricultural Research InstituteFaisalabadPunjab 38000Pakistan Centre of Excellence for Olive Research and Trainings(CEFORT) BaraniAgricultural Research InstituteChakwalPunjabPakistan

Background Bt technology has played significant role in controlling bollworms and increasing cotton yield in earlier days of its introduction,a subsequent decline in yield became apparent over *** decline may be attributed to various environmental factors,pest dynamics,or combination of ***,the present biophysical survey and questionnaire were designed to evaluate the impact of Bt cotton on bollworms management and its effect on reducing spray costs,targeting farmers with varied landholdings and educational ***,data on farmers'cultivated varieties and the prevalence of bollworms and sucking insects in their fields were ***,about eleven thousand cotton samples from farmer fields were tested for Cry1Ac,Cry2Ab and vip3a genes by strip *** In this analysis,83% of the farmers planting approved varieties believe that Bt technology control bollworms,while 17% hold contradictory ***,among farmers cultivating unapproved varieties,77% agree on effectiveness of Bt technology against bollworms,while 23% *** the other hand,67% of farmers planting approved varieties believe that Bt technology does not reduce spray costs,while 33% agree with the ***,78% of farmers cultivating unapproved varieties express doubt regarding its role to reduce spray costs,while 22% are in favour of this *** in opinions on the effectiveness of Bt cotton in controlling bollworms and reducing spray cost between farmers planting unapproved and approved varieties may stem from several *** major cause is the heavy infestation of sucking insects,which is probably due to the narrow genetic variation of the cultivated ***,the widespread cultivation of unapproved varieties(21.67%)is also an important factor to cause different opinions on the effectiveness of Bt *** Based on our findings,we propose that the ineffective control of pests on cotton crop may

关键词： Bollworms Cry1Ac Cry2Ab Cotton Farmer's perception Purposive sampling Sucking insects Unapproved varieties vip3a

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白vips研究进展

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植物保护 2008年第5期34卷 1-5页

作者：申建茹郭巍河北农业大学生命科学学院河北省农作物病虫害生物防治工程技术中心保定071001

苏云金芽孢杆菌Bt营养期杀虫蛋白vips主要分为vip1、vip2和vip33种。vip1和vip2构成二元毒素,对叶甲科昆虫具有特异杀虫活性。vip3对鳞翅目昆虫具有广谱杀虫活性,该蛋白广泛存在于Bt中,与已知杀虫晶体蛋白ICPs没有序列相似性。vip3通过... 详细信息

苏云金芽孢杆菌Bt营养期杀虫蛋白vips主要分为vip1、vip2和vip33种。vip1和vip2构成二元毒素,对叶甲科昆虫具有特异杀虫活性。vip3对鳞翅目昆虫具有广谱杀虫活性,该蛋白广泛存在于Bt中,与已知杀虫晶体蛋白ICPs没有序列相似性。vip3通过诱发细胞凋亡,最终导致昆虫死亡,这与Btδ-内毒素的作用机理完全不同,vips的发现对于Bt的进一步开发利用具有重要意义。本文主要对营养期杀虫蛋白vips的分布、特性、作用机制及应用等进行报道。

关键词：营养期杀虫蛋白二元毒素 vip3a 蛋白特性作用机制

苏云金芽胞杆菌新型vip3基因克隆、表达及活性分析

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苏云金芽胞杆菌新型vip3基因克隆、表达及活性分析

作者：何晓明东北农业大学

学位级别：硕士

农业害虫的危害一直都是我国农业面临的重大难题。我们长期以来大量施用化学农药防治农业害虫。然而由于化学农药的滥用,给人类的健康和环境造成了巨大威胁,同时害虫产生了抗药性,导致田间用药量不断增加,不仅防治成本大幅度的提高,对... 详细信息

农业害虫的危害一直都是我国农业面临的重大难题。我们长期以来大量施用化学农药防治农业害虫。然而由于化学农药的滥用,给人类的健康和环境造成了巨大威胁,同时害虫产生了抗药性,导致田间用药量不断增加,不仅防治成本大幅度的提高,对环境的污染也进一步加重。生物防治是解决这些问题的有效途径之一。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）因其杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的杀虫微生物。具有杀虫活性主要是因为其产生多种具有杀虫活性的蛋白质,如杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins, ICPs）和营养期杀虫蛋白（vegetative insecticidal proteins, vips）。 vips是一类在营养期分泌的新型杀虫毒蛋白,与任何已知的杀虫晶体蛋白没有同源性,其杀虫机理也不同于已知的杀虫晶体蛋白。vips蛋白单独或是与Cry蛋白协同作用,以及组建融合基因构建工程菌,都可以扩大Bt杀虫谱,同时可以抑制害虫抗药性的产生。本研究对72株苏云金芽胞杆菌标准菌株进行vip3类基因型的鉴定,PCR鉴定呈阳性的有18株。利用高分辨熔解曲线（high resolution melting, HRM）检测PCR产物,由于扩增产物的碱基组成不同,不同类型的基因产生不同的熔解曲线,从而对所含有的vip3基因进行了分型。经熔解曲线类型分析,18株阳性菌株中的vip3基因大致分为8种类型。该方法可以高通量地进行基因分型,特别是可以同时检测出已知和新型的vip3类基因。根据已知vip3基因序列设计了PCR引物,成功克隆了五个vip3基因。提交至GeneBank并被国际Bt命名委员会正式命名为vip3aa38、vip3aa39、vip3af3、vip3ag3和vip3Ba2。将vip3基因全长片段插入表达载体pEB中,低温条件下在大肠杆菌Rosetta（DE3）中进行IPTG诱导表达,表达产物为88kDa左右的蛋白。将表达的蛋白进行了对小地老虎、小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾四种鳞翅目昆虫的生物活性测定。vip3aa39蛋白对四种昆虫具有较高的毒力。vip3aa39蛋白与本实验室此前获得的vip3aa11蛋白进行比较,发现两者存在39个氨基酸的差异。用两种蛋白的表达产物分别进行了对小地老虎、小菜蛾、棉铃虫和甜菜夜蛾的杀虫活性测定,结果表明vip3aa39对小地老虎有较高的杀虫活性,LC50为5.43μg/ml,而vip3aa11的LC50为73.62μg/ml;vip3aa39对小菜蛾具有较高的杀虫活性,LC50为140.64μg/ml,而vip3aa11对小菜蛾杀虫活性极低;vip3aa11对棉铃虫具有较高的杀虫活性,LC50为35.18μg/ml,而vip3aa39的LC50仅为286.99μg/ml;vip3aa39和vip3aa11均对甜菜夜蛾具有高毒力,LC50分别为2.02μg/ml和2.04μg/ml。以上结果说明vip3aa39与vip3aa11对小地老虎、小菜蛾、棉铃虫的杀虫活性具有显著不同。

关键词：苏云金芽胞杆菌克隆活性 vip3a