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人免疫缺陷病毒Ⅰ型vif蛋白的原核表达、纯化及单克隆抗体制备

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生物技术通讯 2009年第4期20卷 475-478页

作者：隋洪帅郭东星刘思扬鲍作义刘永健庄道民李韩平李敬云李林军事医学科学院微生物流行病研究所全军艾滋病检测中心病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的:克隆、表达、纯化人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)vif蛋白,制备其单克隆抗体。方法:提取感染了HIV的细胞基因组DNA,PCR扩增vif基因,插入表达载体pET32a,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得工程菌株,IPTG诱导蛋白表达,Western印迹鉴定目的蛋白,... 详细信息

目的:克隆、表达、纯化人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)vif蛋白,制备其单克隆抗体。方法:提取感染了HIV的细胞基因组DNA,PCR扩增vif基因,插入表达载体pET32a,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得工程菌株,IPTG诱导蛋白表达,Western印迹鉴定目的蛋白,亲和层析纯化目的蛋白;免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体。结果:构建了vif蛋白的原核表达载体vif-pET32a,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以包涵体形式存在;纯化获得高纯度的重组vif蛋白,蛋白浓度可达0.56mg/mL;建立了抗vif蛋白单克隆抗体细胞株,制备了腹水,滴度可达1∶16×106,抗体纯化后保持了活性和特异性。结论:在原核表达系统中表达、纯化了重组vif蛋白,制备了针对vif蛋白的单克隆抗体,为研究vif蛋白的功能和抗原性奠定了基础。

关键词：人免疫缺陷病毒Ⅰ型 vif蛋白原核表达单克隆抗体

HIV-1 vif与ElonginC蛋白在大肠杆菌中的共表达

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中国生物制品学杂志 2008年第7期21卷 579-580,583页

作者：朱可彤王小丹杜娟郭博孔维于湘晖吉林大学生命科学学院疫苗研究中心长春130012

目的在大肠杆菌中共表达HIV-1vif与ElonginC蛋白。方法PCR扩增ElonginC基因全长DNA片段,克隆入pMDT-easy载体,经NdeⅠ/BamHⅠ双酶切后,与质粒pRSETB连接,构建质粒pRSETB-ElonginC。将质粒pMRI-vif转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株,再将此菌株制备成感受态细胞,用pRSETB-ElonginC质粒转化该细胞,经1mmol/L IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果质粒pRSETB-ElonginC经NdeⅠ/BamHⅠ双酶切,可切出约3000和400bp的2条片段,测序证明质粒构建正确。在大肠杆菌中共表达了vif与ElonginC蛋白,该蛋白具有良好的抗原特异性。结论在大肠杆菌中共表达了vif与ElonginC蛋白。

关键词：人类免疫缺陷病毒-1 vif蛋白 ElonginC蛋白原核共表达

vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白的表达及纯化

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中国生物制品学杂志 2006年第5期19卷 461-463,467页

作者：张文艳楼朝平朱可彤张帆姜春来吴永革于湘晖孔维吉林大学生命科学学院疫苗研究中心长春130012

目的获得高纯度的vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白。方法以vif/VR1012质粒为模板,PCR扩增出vif-ΔN28基因并插入pRSETB质粒。将构建的原核表达载体vif-ΔN28/pRSETB以及已有的Cullin5-N138/pRSETB质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,产物经Ni-NTA离子纯化柱纯化、复性。结果所表达的vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白约占各自菌体总蛋白的20%,纯化后蛋白纯度均可达90%以上。结论已成功构建了vif-ΔN28原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达,获得了可溶性的纯化的vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白。

关键词：人免疫缺陷病毒 vif蛋白 Cullin5蛋白

HIV-1附属蛋白在HIV-1/HCV共感染中的作用及研究进展

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中国艾滋病性病 2020年第9期26卷 1021-1024页

作者：周正萍黄文昶邹薇南昌大学南昌330006 南昌大学第一附属医院南昌330006

当前,全世界丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染病例人数已从1.7亿增加到1.85亿。同时,大约有400万~500万的HCV感染病例感染了艾滋病病毒(HIV)。许多研究发现,HIV-1/HCV共感染患者中的HIV-1可以通过多种途径加速HCV感染的进程,从而增加肝纤维化... 详细信息

当前,全世界丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染病例人数已从1.7亿增加到1.85亿。同时,大约有400万~500万的HCV感染病例感染了艾滋病病毒(HIV)。许多研究发现,HIV-1/HCV共感染患者中的HIV-1可以通过多种途径加速HCV感染的进程,从而增加肝纤维化和肝癌的风险。最重要的是,共感染中HIV-1的6个附属蛋白:Tat,Rev,vif,Vpr,Vpu和Nef,在促进病毒增殖、诱导免疫抑制和细胞死亡中起着重要作用。本文着重于阐述HIV-1的6个附属蛋白在HIV-1/HCV共感染的发病机理中的作用。

关键词： 1型艾滋病病毒/丙型肝炎病毒 Tat蛋白 Rev蛋白 vif蛋白 Vpr蛋白 Vpu蛋白 Nef蛋白

两种人类传染病相关蛋白的表达、纯化及结构研究

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两种人类传染病相关蛋白的表达、纯化及结构研究

作者：李婷天津大学

学位级别：硕士

人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)和肠道病毒68型(Enterovirus 68,EV68)是严重威胁到公共健康的RNA病毒,目前尚未研制出高效的特异性抗病毒药物和疫苗,因此探索病毒的复制机制以及新的药物靶点一直都是病毒学领域研... 详细信息

人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)和肠道病毒68型(Enterovirus 68,EV68)是严重威胁到公共健康的RNA病毒,目前尚未研制出高效的特异性抗病毒药物和疫苗,因此探索病毒的复制机制以及新的药物靶点一直都是病毒学领域研究的重难点。本研究希望通过对与病毒复制相关的两种蛋白结构和功能的研究,为病毒的致病机理以及设计靶向药物奠定良好的基础。HIV是一种感染人类免疫系统细胞的逆转录病毒,分为HIV-1和HIV-2型,其中HIV-1型是在全球范围内流行的艾滋病的主要病原体。宿主细胞为抑制病毒复制表达了限制性因子APOBEC3H,其HapⅡ亚型最稳定且具有强抗病毒活性和抑制转座子能力,能与HIV-1 vif蛋白结合并被vif拮抗了抗病毒作用,因而被广泛的关注和研究。本研究利用昆虫表达系统表达出大量可溶性A3H hap II蛋白,并证明其能够与HIV-1 vif特异性的结合。我们将构建好的A3H hapII-His重组粘粒Bacmid转染至昆虫sf9细胞并通过扩增获得第三代病毒,进而感染sf9细胞表达和得到目的蛋白。经Ni-NAT亲和层析纯化的目的蛋白,通过免疫共沉淀实验检测与HIV-1 vif之间的特异性结合。本论文研究内容成功建立A3H hap II昆虫表达体系,为进一步研究A3H hapII与HIV-1 vif之间相互作用机制并针对其相互作用位点设计抗HIV药物奠定了基础。EV68是一种主要感染呼吸道的RNA病毒。近几年,不同地区及国家都有不同程度的EV68型感染疫情爆发,因此EV68病毒引起了广泛的关注。EV68病毒基因组编码7种非结构蛋白和4种结构蛋白,其中非结构蛋白3A在复制复合物中具有重要的作用。3A蛋白的可溶区N端(1-61)对3A的生物学功能有重要意义,但目前关于EV68型3A-N结构的研究报道较少。本研究主要通过原核表达系统,表达出大量且高纯度的3A-N蛋白并对其结构进行了初步研究。我们将构建的原核表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达出His-SUMO-3A(1-61)。经Ni-NTA初步纯化及利用ULP酶除去His-SUMO标签,再通过Ni-NTA、阴离子交换柱、分子筛等方法进一步纯化目的蛋白,最终每升大肠杆菌平均可获得约5mg的目的蛋白,且纯度达到95%以上。之后我们通过化学交联反应来证明得到的目的蛋白的多聚化状态。本论文的研究结果为进一步获取3A蛋白晶体、深入研究3A蛋白功能及以3A蛋白为靶点设计抗病毒药物和疫苗奠定了良好的基础。

关键词： HIV-1 肠道病毒68型载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3H vif蛋白 3A蛋白昆虫表达系统蛋白纯化

野生冬虫夏草水提物体外抗HIV-1病毒作用的初步研究

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病毒学报 2016年第4期32卷 417-422页

作者：朱莹马莉胡秦李劲涛陈玉龙贾润清沈思嗣曾毅北京工业大学生命科学与生物工程学院环境与病毒肿瘤学北京市重点实验室中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室四川省林业科学研究院

研究分析野生冬虫夏草的水溶浸提物抑制人免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)的效果及其抗病毒作用的靶点。研究分别选取新鲜虫体、子座、全草、干燥虫体和子座5种不同组分,获得水溶性提取物,采用CCK-8实验检测水... 详细信息

研究分析野生冬虫夏草的水溶浸提物抑制人免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)的效果及其抗病毒作用的靶点。研究分别选取新鲜虫体、子座、全草、干燥虫体和子座5种不同组分,获得水溶性提取物,采用CCK-8实验检测水提物的细胞毒性;假病毒单周期感染实验评价水提物的体外抗病毒活性;体外检测水提物对逆转录酶活性的影响,应用表面等离子共振(SPR)技术检测水提物与HIV-1vif蛋白的相互作用。这5种虫草水提物均具有显著的体外抗HIV-1病毒活性,抑制HIV-1逆转录酶的活性,新鲜子座水提物与vif蛋白有良好的体外结合力。本实验明确了野生冬虫夏草的体外抗病毒活性,其作用机制可能与抑制逆转录酶活性和体外vif蛋白有关,研究将为抗HIV-1病毒药物的研发提供实验基础。

关键词：冬虫夏草 HIV-1病毒逆转录酶 vif蛋白

HIV-1 vif基因的RNA干扰体外研究

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复旦学报（医学版） 2009年第1期36卷 32-36页

作者：江雪艳卢洪洲陈秋丽潘卫张云智沈银忠上海市复旦大学附属公共卫生临床中心感染科上海201508 复旦大学附属华山医院传染科上海200040 复旦大学上海医学院内科学系上海200032 第二军医大学微生物教研室上海200433

目的利用RNAi技术对HIV-1 vif基因的转录后水平进行下调,达到抑制vif蛋白表达的目的,为新的抗HIV治疗和预防研究提供理论基础。方法通过体外转录法合成siRNA,与转接有vif基因的表达质粒共同转染HEK293T细胞,荧光显微镜下观察干扰效果,... 详细信息

目的利用RNAi技术对HIV-1 vif基因的转录后水平进行下调,达到抑制vif蛋白表达的目的,为新的抗HIV治疗和预防研究提供理论基础。方法通过体外转录法合成siRNA,与转接有vif基因的表达质粒共同转染HEK293T细胞,荧光显微镜下观察干扰效果,并利用Real-time PCR和Western blot对HIV-1 vif分别从转录和表达水平进行验证。结果将pEGFP-N1-vif重组载体转染HEK 293T细胞后,结果显示vif蛋白可以在细胞中高水平表达;针对vif设计的3段特异的siRNA可以有效且特异地降低vif蛋白的表达。结论RNAi技术可以下调HIV-1蛋白的表达,此技术可以作为一项新的治疗和预防HIV-1的方法用于进一步的研究。

关键词：人类免疫缺陷病毒(HIV) vif基因 vif蛋白 RNAi siRNA 人胚肾293T细胞 pEGFP—N1质粒

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APOBEC家族的防御机制

现代预防医学 2006年第1期33卷 41-43页

作者：吴小霞马义才电子科技大学生命科学与技术学院电子科技大学生命科学与技术学院成都610054

固有免疫是与生俱来的,从出生到死亡一直在起着重要的防御抵抗作用.当病原体对机体侵害时,免疫系统就去积极调动各个成员,比如抗菌肽,蛋白分解级联分子,信号转导分子如干扰素,还有专门的吞噬细胞等来一起抵御病原体.而事实上即使是单细... 详细信息

固有免疫是与生俱来的,从出生到死亡一直在起着重要的防御抵抗作用.当病原体对机体侵害时,免疫系统就去积极调动各个成员,比如抗菌肽,蛋白分解级联分子,信号转导分子如干扰素,还有专门的吞噬细胞等来一起抵御病原体.而事实上即使是单细胞生物的外膜和多细胞生物的上皮细胞表面也是固有免疫的防御系统,它们一直是对抗感染的屏障[1]

关键词：固有免疫人类免疫缺陷病毒HIV vif蛋白 CEM15/APOBEC3G APOBEC1 AID APOBEC3F

基于vif突变体文库设计和评价靶向vif-CBF-β结合位点的HIV-1肽类抑制剂

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基于Vif突变体文库设计和评价靶向Vif-CBF-β结合位点的HIV-1肽类...

作者：王诗琦吉林大学

学位级别：硕士

HIV(human immunodeficiency virus)即人类免疫缺陷病毒,能够感染人类免疫系统引起艾滋病的发生。HIV-1在感染宿主细胞后,其辅助蛋白vif招募胞内泛素相关支架蛋白Cullin5(CRL5)、接头蛋白ElonginB(EloB)和ElonginC(EloC)以及T细胞趋化因... 详细信息

HIV(human immunodeficiency virus)即人类免疫缺陷病毒,能够感染人类免疫系统引起艾滋病的发生。HIV-1在感染宿主细胞后,其辅助蛋白vif招募胞内泛素相关支架蛋白Cullin5(CRL5)、接头蛋白ElonginB(EloB)和ElonginC(EloC)以及T细胞趋化因子CBF-β形成E3泛素连接酶复合物,对胞内宿主限制因子APOBEC3G蛋白(A3G)进行泛素化标记,使其通过蛋白酶体途径被降解,从而拮抗A3G抗HIV-1的功能。如果阻断vif与复合物中其它蛋白间的结合作用,抑制E3复合物的形成,那么A3G蛋白将不被降解从而被包装进新生HIV-1病毒颗粒内,发挥其胞嘧啶脱氨酶活性,对HIV-1基因组造成高频突变达到抑制HIV-1病毒复制的效果。在以往的研究中,研究者利用计算机辅助药物设计、基于荧光共振能量转移的高通量筛选和噬菌体表面展示技术等方法发现了多种具有抗HIV作用的药物。在以抑制vif-E3泛素连接酶复合物形成为靶点方面,已经有多篇阻断vif寡聚、阻断vif结合A3G和阻断vif结合EloC的抑制剂的研究被报道。多种结果表明,阻断vif-E3复合物的形成,将会抑制vif介导的对A3G蛋白的降解作用,并且能对多种亚型的HIV-1病毒产生一定抑制作用。而在E3复合物的多个蛋白-蛋白相互结合界面中,由于vif与CBF-β蛋白的结合界面相对较大,使得阻断这一靶点的抑制剂鲜有报道。因此在本论文中,我们将利用酵母表面展示技术,和在前期研究中已经建立的vif蛋白突变体文库,通过流式细胞术筛选与CBF-β蛋白亲和力更强的vif突变体,并根据获得的突变位点设计多肽类抑制剂,以阻断vif介导的A3G降解,从而恢复其抑制HIV-1的能力。首先将CBF-β蛋白与前期构建的vif突变体展示文库进行孵育,通过3轮流式分选,富集并获得了与CBF-β结合力强于野生型vif的突变体。再通过扩增突变体的基因并进行序列比对,获得了30条突变体序列,其中与已报道的vif与CBF-β结合相关的氨基酸位点重合率可达到32.14%,证明了本论文所使用筛选体系的可信度。随后根据获得的突变位点,设计了9条源于vif突变体的小肽(9-18个氨基酸),利用计算机软件进行分子对接后,筛选出了6条小肽进行合成,并对其抗HIV-1病毒感染及复制的能力进行了检测。结果表明小肽63M和108M具有抑制HIV-1感染作用,IC值分别为32.7μM和74.0μM,并且在一定浓度下具有抑制HIV-1复制的效果。接下来,对这两条小肽的细胞毒性、细胞摄入能力和抗病毒机制进行了研究。结果显示在浓度低于100μM时,63M和108M对多种细胞均无毒性作用,且HEK293T细胞能够有效摄入小肽。在探索63M、108M抗HIV-1机制的过程中,我们发现二者在体外和HEK293T细胞内均具有抑制vif结合CBF-β的效果,同时可在胞内保护A3G蛋白不被降解,相应地提高了A3G蛋白在病毒粒子内的包装量。综上所述,通过本论文的研究,获得了两条针对vif-CBF-β靶点的具有一定抗HIV-1功能的小肽,这些结果将有助于拓宽抗HIV-1肽类抑制剂的潜在研究靶点。在后续研究中,我们将以提高小肽稳定性和降低其IC值为目的对小肽进行修饰和优化,期望发现抑制能力更强的HIV-1肽类抑制剂。

关键词： HIV-1 vif蛋白 CBF-β蛋白酵母表面展示技术多肽抑制剂