检索结果-南通市图书馆

作者：谢中艺江苏大学

学位级别：硕士

目的:伤寒沙门菌（Salmonella enterica serotype Typhi,***）vi荚膜多糖是其独特的毒力因子。在伤寒沙门菌感染巨噬细胞过程中,自噬作用在宿主清除胞内菌中占有重要地位,但沙门菌也衍生出了抵御或利用自噬的策略。本课题组前期利用RNA-... 详细信息

目的:伤寒沙门菌（Salmonella enterica serotype Typhi,***）vi荚膜多糖是其独特的毒力因子。在伤寒沙门菌感染巨噬细胞过程中,自噬作用在宿主清除胞内菌中占有重要地位,但沙门菌也衍生出了抵御或利用自噬的策略。本课题组前期利用RNA-seq技术分析***感染的巨噬细胞转录组,提示多个自噬相关基因发生差异表达。因此,本论文主要对***荚膜多糖与巨噬细胞自噬作用展开研究,以期阐明vi荚膜多糖的表达特性,功能和作用机制。方法:***感染的巨噬细胞自噬水平分析分别获取***感染巨噬细胞各时相下的总RNA和总蛋白。用q RT-PCR检测自噬相关基因的m RNA水平;用western blot检测OPTN,p62,NDP52和LC3。***荚膜多糖的表达特性研究（1）胞外:分别获取***在SOB和LB液体培养基中静置培养2 h,8 h,12 h的总RNA,用q RT-PCR检测tviA,tvi B的m RNA水平。（2）胞内:q RT-PCR检测***感染巨噬细胞不同时间段下tviA,tvi B的m RNA水平;用流式细胞术和免疫荧光法检测不同感染时间段下巨噬细胞内vi荚膜多糖的荧光强度。3.相关菌株构建（1）ΔtviA和Δvex E:利用自杀质粒法和同源重组技术,分别制备***荚膜多糖编码基因tviA（调控作用）和vex E（运输作用）的缺陷变异株。（2）ΔtviA-p BAD33-tviA（C-ΔtviA）和Δvex E-p BAD33-vex E（C-Δvex E）:将tviA基因和vex E基因的编码区分别克隆至p BAD33表达质粒,电转化至ΔtviA和Δvex E,制备ΔtviA回补株（C-ΔtviA）和Δvex E回补株（C-Δvex E）。同时向野生株WT,ΔtviA和Δvex E中导入p BAD33空质粒作为对照菌株（分别为WT-p BAD33,ΔtviA-p BAD33,Δvex E-p BAD33）。***荚膜多糖基因tviA,vex E的功能研究（1）生长曲线测定:绘制WT,ΔtviA和Δvex E在SOB液体培养基中静置培养条件下的生长曲线,分析vi荚膜多糖编码基因对细菌生长的影响。（2）巨噬细胞胞内生存试验:SOB静置培养并用L-阿拉伯糖诱导C-ΔtviA,C-Δvex E,WT-p BAD33,ΔtviA-p BAD33,Δvex E-p BAD33,将菌与巨噬细胞共培养后杀死胞外菌,并将各组细胞裂解物涂于LB平板计数菌落数T0。再分别将其余细胞继续培养2 h,12 h和24 h后裂解涂板并计数菌落。计算各菌株的T2/T0、T12/T0、T24/T0,以比较各菌株的胞内生存能力。（3）tviA,vex E对巨噬细胞自噬作用的影响:SOB静置培养并用L-阿拉伯糖诱导WT-p BAD33,ΔtviA-p BAD33,C-ΔtviA,Δvex E-p BAD33,C-Δvex E,收集以上菌株感染巨噬细胞的总蛋白,用western blot分析LC3和p62蛋白水平;WT,ΔtviA,Δvex E感染巨噬细胞,用免疫荧光法检测后胞内的LC3点状聚集,用流式细胞术检测胞内LC3荧光强度,q RT-PCR检测Nod1,Nod2,Galectin8基因的m RNA水平。结果:***感染的巨噬细胞自噬水平分析（1）***感染巨噬细胞的转录组数据分析,提示在感染2 h或24 h,至少有21个与自噬途径相关基因的表达水平发生改变。q RT-PCR验证部分基因Rnf166,Atg4c,Atg16l1,Rubcnl,Lamp3,Casp1,Dapk1的m RNA水平变化与转录组基因的动态变化总体一致。（2）***感染与自噬作用的动态分析,表明与未感染组相比,感染30 min内,Rnf166,Atg4c,Atg16l1,Rubcnl,Lamp3,Casp1,Dapk1的m RNA水平均有上升趋势。感染6 h内,上调大部分Ndp52,p62,Optn,Galectin8,Lamp1,Rubcn,Lc3b的m RNA水平,但感染6 h的p62,Lc3b和Lamp1的m RNA略微下降;Western blot结果表明,感染2 h-6 h的OPTN,p62蛋白水平下降,LC3-II上升,感染12 h-24 h,OPTN及p62蛋白表达量明显上升,NDP52变化不显著,24 h的LC3-II含量达到最高。***荚膜多糖的表达特性研究（1）不同培养条件下的***荚膜多糖表达分析,表明SOB液体培养基中*** tviA和tvi B的m RNA水平

关键词：伤寒沙门菌巨噬细胞自噬 vi荚膜多糖 tviA vexE

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伤寒沙门菌vi荚膜多糖影响巨噬细胞凋亡及TRAIL通路的机制研究

伤寒沙门菌Vi荚膜多糖影响巨噬细胞凋亡及TRAIL通路的机制研究

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作者：尹芬芬江苏大学

学位级别：硕士

目的:巨噬细胞是伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhi,***）感染过程中主要的宿主细胞,本研究通过***感染经PMA诱导的THP-1细胞,探究***及其毒力因子vi荚膜多糖对巨噬细胞凋亡及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumor necrosi... 详细信息

目的:巨噬细胞是伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhi,***）感染过程中主要的宿主细胞,本研究通过***感染经PMA诱导的THP-1细胞,探究***及其毒力因子vi荚膜多糖对巨噬细胞凋亡及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）信号通路的影响。方法:1.转录组测序:***野生株WT感染THP-1细胞0 h、4 h和26 h,提取巨噬细胞RNA进行转录组测序（RNA-seq）。***-seq数据整理及分析:筛选出RNA-seq结果中与细胞凋亡相关且存在变化的数据,通过定量PCR（quantitative PCR,q PCR）技术分析***感染THP-1细胞早期和晚期凋亡相关基因的表达水平。***感染THP-1细胞后细胞凋亡的检测:***感染THP-1细胞0 h、6 h和24 h,流式细胞术检测THP-1细胞凋亡率,western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的剪切水平。***感染THP-1细胞后TRAIL信号通路的检测:***感染THP-1细胞0 h、6 h和24 h,western blot检测TRAIL信号通路中配体TRAIL和死亡受体DR5的蛋白表达水平;外源加入TRAIL抗体中和TRAIL蛋白,western blot检测WT感染细胞6 h Caspase-3蛋白的剪切水平,流式细胞术检测THP-1细胞凋亡率的变化。***感染THP-1细胞后vi荚膜多糖表达水平的检测:***感染THP-1细胞2 h和24 h,提取RNA通过q PCR技术检测vi相关基因tvi A、tvi B的表达变化。***缺陷株感染THP-1细胞后细胞凋亡的检测:*** vi缺陷株（Δtvi A、Δvex E、Δtvi B-vex E）和WT感染THP-1细胞6 h和24 h,western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的剪切水平,流式细胞术检测THP-1细胞凋亡率。***缺陷株感染THP-1细胞后TRAIL信号通路的检测:*** vi缺陷株（Δtvi A、Δvex E、Δtvi B-vex E）和WT感染THP-1细胞6 h和24 h,western blot检测TRAIL信号通路中配体TRAIL和死亡受体DR5的蛋白表达变化。vi缺陷株（Δtvi A、Δvex E、Δtvi B-vex E）和WT感染细胞1 h、2 h和24 h,q PCR技术分析Tnfsf10（编码TRAIL蛋白）、Tnfrsf10b（编码DR5蛋白）基因的表达水平。外源加入TRAIL抗体中和TRAIL蛋白,western blot检测Δvex E感染细胞6 h Caspase-3蛋白的剪切水平,流式细胞术检测THP-1细胞凋亡率的变化。结果:1.筛选出RNA-seq结果中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等12个凋亡相关基因,整理后进行分析,q PCR分析结果与RNA-seq结果基本一致。***感染THP-1细胞后,细胞凋亡率明显高于未感染细胞组（p＜0.05）,凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9激活明显增加,蛋白经剪切后的条带明显强于未感染细胞组,且感染晚期细胞凋亡较早期增加（p＜0.05）,细胞凋亡呈现动态变化。***感染THP-1细胞后,TRAIL信号通路中配体TRAIL和死亡受体DR5的蛋白表达较未感染时明显增加,且随感染时间增加蛋白条带增强;加入TRAIL抗体处理后,Caspase-3蛋白激活减少,剪切条带明显减弱,凋亡的巨噬细胞数量明显减少（p＜0.05）。***感染THP-1细胞早期vi相关基因tvi A、tvi B转录水平表达较高,感染晚期vi表达有所下降（p＜0.05）。5.与WT感染相比,vi缺陷株（Δtvi A、Δvex E、Δtvi B-vex E）感染THP-1细胞6 h和24 h,凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的激活均显著增加,剪切条带明显增强,细胞凋亡率增加（p＜0.05）。6.与WT感染相比,vi缺陷株（Δtvi A、Δvex E、Δtvi B-vex E）感染THP-1细胞6 h和24 h,配体蛋白TRAIL表现出显著的表达上调,受体蛋白DR5未有明显变化。7.与WT感染相比,vi缺陷株（Δtvi A、Δvex E、Δtvi B-vex E）感染THP-1细胞1 h,Tnfsf10基因均

关键词：伤寒沙门菌巨噬细胞凋亡 vi荚膜多糖 TRAIL通路

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不同条件下伤寒沙门菌vi荚膜多糖的表达调控研究

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微生物与感染 2021年第4期16卷 227-234页

作者：尹芬芬谢中艺杨帆帆生秀梅黄新祥张盈江苏大学医学院江苏镇江212013

为探究不同培养条件对伤寒沙门菌vi荚膜多糖表达的影响及vi荚膜多糖对细菌在巨噬细胞内生存能力的影响,本研究将伤寒沙门菌在LB培养条件下给予不同应激或在不同培养基中培养,通过实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real time fluorescent ... 详细信息

为探究不同培养条件对伤寒沙门菌vi荚膜多糖表达的影响及vi荚膜多糖对细菌在巨噬细胞内生存能力的影响,本研究将伤寒沙门菌在LB培养条件下给予不同应激或在不同培养基中培养,通过实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,real time RT-PCR)检测vi荚膜多糖相关基因的转录水平,并采用流式细胞术检测vi荚膜多糖的表达水平。将野生(wild type,WT)株和vi荚膜多糖缺陷(ΔvexE)株分别感染巨噬细胞,观察其胞内生存能力。结果显示,加入氧应激、Mg^(2+)应激、抗菌肽应激后,tviA、tviB、vexE基因表达下调,加入酸应激和在SOB、LPM、M9培养基中培养后,tviA、tviB、vexE基因表达上调;除氧应激外,其余应激组流式细胞术结果与real time RTPCR结果一致。与WT株相比,ΔvexE株在巨噬细胞内生存能力明显下降。结果表明,酸应激及SOB、LPM、M9培养基促进了vi荚膜多糖表达,Mg^(2+)应激、抗菌肽应激则抑制了vi荚膜多糖表达,氧应激对vi荚膜多糖表达的影响有待进一步研究;vi荚膜多糖有利于伤寒沙门菌在巨噬细胞内生存。

关键词：伤寒沙门菌 vi荚膜多糖应激胞内生存

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