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分子植物育种 2023年

作者：秦浩翔唐昀昀张剑侠西北农林科技大学园艺学院旱区作物逆境生物学国家重点实验室农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室

脱水诱导19 (drought-induced 19， Di19)蛋白在植物非生物胁迫过程发挥重要作用，然而有关其参与寒胁迫的研究很少报道。我们前期从中国野生山葡萄‘双优’的cDNA文库中筛选得到转录因子VaCBF6的互作蛋白vadi19-3，本研究通过对vadi19-... 详细信息

脱水诱导19 (drought-induced 19， Di19)蛋白在植物非生物胁迫过程发挥重要作用，然而有关其参与寒胁迫的研究很少报道。我们前期从中国野生山葡萄‘双优’的cDNA文库中筛选得到转录因子VaCBF6的互作蛋白vadi19-3，本研究通过对vadi19-3基因克隆、生物信息学分析、亚细胞定位和转录自激活分析，结果表明vadi19-3编码一个核膜定位且具有转录自激活活性的锌指转录因子；通过表达模式分析，表明vadi19-3是受低温诱导的差异表达基因，且主要在‘双优’葡萄茎和卷须中表达；通过对vadi19-3基因启动子顺式作用元件及GUS活性分析，表明启动子中分布有大量转录因子结合位点，且其活性显著受低温诱导。通过对拟南芥遗传转化vadi19-3进行功能分析，表明该基因可通过降低相对电解质渗透、丙二醛含量，提高脯氨酸含量、可溶性糖含量和抗氧化物酶活性从而提高转基因拟南芥的抗寒性。此外，通过酵母双杂交和双分子荧光互补试验，证实vadi19-3可与脯氨酸通路合成蛋白酶VaP5CS在体内和体外发生相互作用。总之，本研究初步证实vadi19-3属于抗寒转录因子，且可与VaP5CS协同发挥作用，为深入揭示中国野生山葡萄抗寒互作网络建成和进行葡萄分子育种提供基础。

关键词：中国野生山葡萄 vadi19-3 功能分析互作蛋白

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中国野生山葡萄vadi19-3基因的抗寒功能分析

中国野生山葡萄VaDi19-3基因的抗寒功能分析

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作者：唐昀昀西北农林科技大学

学位级别：硕士

葡萄(Vitis vinifera L.)是世界上栽培面积最大的经济作物之一,被广泛用作鲜食、酿酒、制干、制汁和制罐。我国葡萄的主栽区多为干旱或半干旱地区,这些地区冬季大多寒冷干燥,冻害是葡萄生产上存在的突出问题。解决这一问题的途径通常是... 详细信息

葡萄(Vitis vinifera L.)是世界上栽培面积最大的经济作物之一,被广泛用作鲜食、酿酒、制干、制汁和制罐。我国葡萄的主栽区多为干旱或半干旱地区,这些地区冬季大多寒冷干燥,冻害是葡萄生产上存在的突出问题。解决这一问题的途径通常是通过杂交育种选育抗寒性强的葡萄新品种,但这种方法育种周期长、见效慢。分子生物学的发展为葡萄抗寒育种提供了新途径,研究葡萄属中最抗寒的中国野生山葡萄(V.amurensis Rupr.)的抗寒关键基因,通过分子育种手段培育抗寒葡萄新品种具有重要意义。在本课题组前期研究获得山葡萄抗寒转录因子VaDREB,并筛选出VaDREB的一个互作蛋白vadi19-3的基础上,本研究克隆vadi19-3基因并分析其抗寒功能,以期为进一步揭示其抗寒分子机制奠定基础。获得的主要结果如下:1.克隆了山葡萄‘双优’中的vadi19-3基因,该基因CDS全长663bp,编码220个氨基酸,包含zf-Di19和Di19＿C两个保守结构域。亚细胞定位显示,vadi19-3位于细胞核与细胞膜上。对山葡萄‘双优’和欧洲葡萄‘红地球’植株进行4℃低温处理,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,随着低温处理时间的延长,Di19-3的表达量持续升高,且‘双优’中表达量明显高于‘红地球’。Di19-3在‘双优’和‘红地球’的根、茎、叶、卷须中均有表达,但表达水平存在差异。Di19-3在‘双优’茎中表达量最高,而在‘红地球’根中表达量最高。2.通过农杆菌介导法,将vadi19-3的过表达载体转化拟南芥,获得vadi19-3的纯合T3代转基因植株。经PCR、qRT-PCR和Western blot检测,获得了3个转基因株系OE-1、OE-2、OE-5。对四周龄的野生型(WT)和转基因拟南芥进行低温(-6℃)处理,结果显示,低温处理后转基因拟南芥的生存率高于WT,电导率、MDA含量低于WT,脯氨酸、可溶性糖含量和SOD、POD、CAT活性均高于WT。对WT和转基因拟南芥0℃处理后,通过qRT-PCR分析抗寒相关基因的表达水平,发现转基因植株中除NCED3的表达水平变化不明显外,CBF1、CBF2、CBF3、COR15A、P5CS2、COR47、RD29A、KIN1等基因的表达量均有明显上调,这表明vadi19-3通过非依赖ABA的CBF途径调控低温响应基因的表达,从而提高拟南芥的耐寒性。3.克隆‘双优’和‘红地球’中Di19-3的启动子片段,对二者启动子顺式作用元件分析发现,P-vadi19-3和P-Vv Di19-3中都含有AE-box、Box4、P-box、W box以及TC-rich repeats等顺式作用元件,但在数量上存在些微差异。GUS组织化学染色和GUS蛋白活性分析结果表明,P-vadi19-3和P-Vv Di19-3均受低温诱导,但P-vadi19-3的表达活性要强于P-Vv Di19-3。4.在酵母中vadi19-3具有转录激活活性。以vadi19-3的一个片段vadi19-3 d6为诱饵质粒,酵母双杂交筛选出3个候选互作蛋白VaTLP、VaPR10和VaP5CS。双分子荧光互补试验进一步证实vadi19-3与3个候选蛋白之间存在互作关系,且这种相互作用发生在细胞核与细胞膜上。

关键词：中国野生山葡萄抗寒性 vadi19-3 拟南芥功能分析

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