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Efficient transfer and expression of human clotting factor IX cDNA in neonatal hemophilia B mice mediated by vsv-g pseudotyped retrovi-rus

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Chinese Science Bulletin 2001年第18期46卷 1534-1538页

作者： WANg Hongwei YE Chenbo CHEN Li WANg Xuefeng QIU Xinfang XUE Jinglun LU Daru State Key Laboratory of genetic Engineering Institute of GeneticsSchool of Life SciencesFudan UniversityShanghai 200433China Institute of Hematology Ruijin Hospital of Shanghai Second Medical UniversityShanghai 200032China

The feasibility of in vivo gene therapy for hemophilia B by vsv-g pseudotyped retroviral vector was introduced. The novel packaging cell line 293gPg was used to produce vsv-g/g1NaBAIX pseudotyped virus with the highest liters up to 8.5×108cfu .mL-1. In contrast to the conventional retrovirus, vsv-g pseudotyped virus was more resistant to inactivation by serum complements (Pvsv-g pseudotyped virus was more stable in neonatal mice serum than in adult mice serum (Pgen was detected and lasted for more than 120 d, the highest level reached (72.5+6.1) ng- mL11. Moreover, the functional activity was improved to some extent in all hFIX-treated mice, the most remarkable improvement was observed in the mice treated with higher dose of virus whose clotting activity increased to (3.4±1.5)% and APTT (activated partial thromboplastin time) reduced to (43.2±7.2) s. The anti-hFIX antibody was

关键词： neonatal gene therapy vsv-g pseudotyped retrovirus in vivo gene transfer.

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复制型慢病毒vsv-g qPCR检测方法的验证及初步应用

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中华微生物学和免疫学杂志 2021年第7期41卷 538-544页

作者：吴雪伶赵翔孟淑芳中国食品药品检定研究院生物制品检定所细胞资源保藏研究中心卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的建立复制型慢病毒(replication competent lentivirus,RCL)vsv-g qPCR检测方法,并进行方法学性能验证及初步应用。方法以慢病毒载体包膜vsv-g基因为目标序列,建立荧光定量PCR检测方法,并对方法的专属性、线性、扩增效率、精密度、... 详细信息

目的建立复制型慢病毒(replication competent lentivirus,RCL)vsv-g qPCR检测方法,并进行方法学性能验证及初步应用。方法以慢病毒载体包膜vsv-g基因为目标序列,建立荧光定量PCR检测方法,并对方法的专属性、线性、扩增效率、精密度、准确度、线性范围、检测限、定量限及耐用性进行验证。利用所建立的方法进行CAR-T细胞、慢病毒载体生产终末细胞及慢病毒载体收获液样品的初步应用性研究。结果建立的vsv-g荧光定量PCR法,专属性较好,对293T细胞、PBMC细胞及C8166细胞均无特异性扩增,线性范围为1×10^(2)拷贝/test~1×10^(9)拷贝/test,R2能够达到0.998以上,扩增效率在93%~98%之间,精密度RSDvsv-g实时荧光定量PCR法,各项验证参数均可满足检测要求,该方法的应用将进一步提高慢病毒载体相关产品的安全性。

关键词：复制型慢病毒 vsv-g 嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)

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应用HSV-TK系统，研究ATRA和vsv-g对耐药AML细胞的杀伤作用

应用HSV-TK系统，研究ATRA和VSV-G对耐药AML细胞的杀伤作用

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作者：胡晨曦苏州大学

学位级别：硕士

急性髓系白血病（AML）细胞对化疗药物的耐受性是临床上治疗AML的一个主要障碍。近年来，无论是在实验阶段还是临床治疗中，自杀基因疗法已经开始广泛地用于肿瘤的治疗。本论文中，我们选用了最常用的自杀基因系统HSV-TK/gCV系统，研... 详细信息

急性髓系白血病（AML）细胞对化疗药物的耐受性是临床上治疗AML的一个主要障碍。近年来，无论是在实验阶段还是临床治疗中，自杀基因疗法已经开始广泛地用于肿瘤的治疗。本论文中，我们选用了最常用的自杀基因系统HSV-TK/gCV系统，研究了该系统在杀伤耐受化疗药物的AML细胞方面的潜在作用。首先，我们分别筛选了耐受阿糖胞苷（Ara-C）和多柔比星的白血病细胞系，在细胞培养过程中证明了HSV-TK/gCV系统可以有效地抑制耐受化疗药物的白血病细胞的生长，而且不同的白血病细胞系对该系统具有相似的敏感性。其次，研究结果证明全反式维甲酸（ATRA）的加入可以引起一种重要的间隙连接蛋白Connexin43表达水平的上调，还能在一定程度上增强HSV-TK/gCV系统对白血病细胞的杀伤效果。有趣的是，膜融合蛋白vsv-g的加入也可以通过促进白血病细胞间的融合而增强HSV-TK/gCV系统的杀伤效应。将稳定表达HSV-TK和vsv-g的耐药细胞混合培养后加入gCV，发现vsv-g的表达可以增强HSV-TK/gCV系统的旁观者效应。除此以外，我们还发现vsv-g和ATRA同时作用于HSV-TK/gCV系统可以使其杀伤耐药AML细胞的效果更显著。综上所述，HSV-TK/gCV系统可以直接作用于耐受化疗药物的人AML细胞，并且ATRA和vsv-g的使用可以通过增强旁观者效应而有效地提高该系统的杀伤力。这些结果为HSV-TK/gCV系统应用于临床治疗耐药性AML奠定了理论基础。

关键词： vsv-g ATRA 旁观者效应耐受化疗药物的白血病细胞 HSV-TK/gCV

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MultiBac高效展示系统建立及vsv-g融合修饰的应用研究

MultiBac高效展示系统建立及VSV-G融合修饰的应用研究

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作者：郑浩华南农业大学

学位级别：硕士

杆状病毒表面展示系统是近年来快速发展的一种真核生物表面展示系统,其主要原理是将外源基因与囊膜蛋白基因进行融合,导入昆虫细胞内进行融合表达,使外源蛋白在囊膜蛋白的介导下展示在重组杆状病毒囊膜或被感染的细胞膜表面。杆状病毒... 详细信息

杆状病毒表面展示系统是近年来快速发展的一种真核生物表面展示系统,其主要原理是将外源基因与囊膜蛋白基因进行融合,导入昆虫细胞内进行融合表达,使外源蛋白在囊膜蛋白的介导下展示在重组杆状病毒囊膜或被感染的细胞膜表面。杆状病毒表面展示系统具有病毒滴度高、外源基因容纳能力大、翻译后修饰机制完善等优点,已广泛应用于基因呈递、癌细胞靶向攻击、单克隆抗体制备和新型多价疫苗研发等领域。杆状病毒表面展示系统中,常使用groupⅠ型杆状病毒的gP64介导外源蛋白的融合展示,该蛋白具有分布极性,其受体位点仅存在于杆状病毒囊膜极性区域。病毒复制周期中,野生型gP64蛋白常与gP64融合蛋白之间发生强烈的竞争性抑制,引起杆状病毒表面展示效率低等缺点。为了有效解决杆状病毒的表面展示和基因呈递效率低等缺陷,本研究利用细菌内同源重组、双荧光素酶检测,Westren Blot鉴定和激光共聚焦断层扫描等技术,分别开展了突变型rSw106-inv菌株(Ac-Zeo-ph\Δp64)的构建、Ac-Zeo-ph\Δp64应用于重组杆状病毒的复制周期研究、Ac-Zeo-ph\Δp64应用于重组杆状病毒的表面展示效率检测和Ac-Zeo-ph\Δp64进行vsv-g介导的融合展示等研究,获得如下结果:1)Ac-Zeo-ph\Δp64的构建利用over-lap PCR技术构建出同源重组片段,电转化导入Invasin介导的DAP缺陷型Sw106受体菌E.coli AcMultiBac/Δasd Sw106/PgB2?Inv(野生型rSw106-inv菌株Ac),完成细菌内Red同源重组过程,成功构建了延迟rAcMultiBac中gp64基因表达的突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-ph\Δp64。2)Ac-Zeo-ph\Δp64应用于重组杆状病毒的复制周期研究对突变型rAcMultiBac进行延迟表达野生型gP64蛋白等研究,结果表明延迟表达野生型gP64蛋白对重组杆状病毒复制周期无明显影响。3)Ac-Zeo-ph\Δp64应用于重组杆状病毒的展示效率检测将海肾荧光素酶报告基因和gp64基因进行融合,利用萤火虫荧光素酶报告基因作为内参基因,共同导入突变型rAcMultiBac,双荧光素酶检测技术对重组杆状病毒的表面展示效率进行检测。结果表明,应用突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-ph\Δp64构建的重组杆状病毒可将表面展示效率提高约0.8倍。4)应用Ac-Zeo-ph\Δp64开展vsv-g介导的融合展示研究vsv-g基因的密码子使用偏好性分析结果表明,vsv-g基因在sf9细胞中具有较好的表达效果。利用Ac-Zeo-ph\Δp64成功构建了vsv-g介导的egfp展示重组杆状病毒。激光共聚焦扫描显微镜检测结果表明,vsv-g介导的外源蛋白均成功的展示在sf9细胞膜表面,Western Blot鉴定结果表明外源蛋白成功组装至子代杆状病毒。该研究成功构建了可应用于杆状病毒多基因高效展示系统的菌株平台,均有效解决了传统杆状病毒表面展示效率低的缺点;利用vsv-g介导的外源基因融合展示等研究,为重组杆状病毒广泛应用于非囊膜蛋白表面展示和非宿主细胞基因呈递等领域的研究奠定基础。

关键词：杆状病毒高效展示 vsv-g 表面展示

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逆转录病毒法制备转基因鸡的方法分析

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中国农学通报 2007年第8期23卷 1-7页

作者：满朝来陈岩哈尔滨工业大学生命科学与工程系黑龙江哈尔滨150001

随着生物制药业的迅速发展,转基因鸡已逐渐成为生物领域研究的热点之一。为建立和优化逆转录病毒法制备转基因鸡技术平台,以pHIT-Myc3为载体,以增强型绿色荧光蛋白(EgFP)为标记基因,采用共转染法包装泛嗜性vsv-g假逆转录病毒,浓缩后分... 详细信息

随着生物制药业的迅速发展,转基因鸡已逐渐成为生物领域研究的热点之一。为建立和优化逆转录病毒法制备转基因鸡技术平台,以pHIT-Myc3为载体,以增强型绿色荧光蛋白(EgFP)为标记基因,采用共转染法包装泛嗜性vsv-g假逆转录病毒,浓缩后分别体外侵染鸡胚胎成肌细胞和体内胚盘下腔接种新生种蛋并孵化出雏。分别抽提成肌细胞、孵化5d的全胚和新生雏鸡不同脏器的基因组DNA进行PCR鉴定分析,结果分别在细胞和5d全胚胎及新生雏鸡的胸腺和皮肤中检测到了标记基因EgFP的存在,表明逆转录病毒法成功制备出转基因鸡,同时转基因鸡技术平台中的方法技术条件也得到了有效优化,为转基因鸡的进一步研究提供参考。

关键词：逆转录病毒 EgFP vsv-g 转基因鸡

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IFITM1\2\3的克隆表达及其抗病毒作用研究

IFITM1\2\3的克隆表达及其抗病毒作用研究

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作者：李沂吉林农业大学

学位级别：硕士

干扰素诱导的跨膜蛋白家族,又被称作IFITM家族,最近的研究表明其具有一定的抗病毒作用,本研究首先设计了克隆ifitm1, ifitm2, ifitm3三种基因的上下游引物,在再通过以IFN-α作为诱导剂,诱导人胚肾293T细胞胞内表达IFITM1, IFITM2, IFITM... 详细信息

干扰素诱导的跨膜蛋白家族,又被称作IFITM家族,最近的研究表明其具有一定的抗病毒作用,本研究首先设计了克隆ifitm1, ifitm2, ifitm3三种基因的上下游引物,在再通过以IFN-α作为诱导剂,诱导人胚肾293T细胞胞内表达IFITM1, IFITM2, IFITM3三种目的蛋白,通过RT-PCR方法,克隆ifitm1, ifitm2, ifitm3三种基因,并将扩增产物连接至pMD18-T-sinple载体上,通过测序验证重组质粒的正确性,然后进一步将目的基因切下连接至pVAX1载体,通过转染试剂,将重组质粒转染致293T细胞,通过RT-PCR、 western-blot和IFA实验验证重组质粒在细胞内的表达情况,并命名为pV-IFITM1, pV-IFITM2, pV-IFITM3。利用pLP1, pLP2, pNL-EgFP, pLP-vsvg四质粒系统包装vsv-g假病毒,并通过RT-PCR及细胞感染实验,验证4质粒包装病毒是否成功。将上述构建正确三种质粒pV-IFITM1, pV-IFITM2, pV-IFITM3分别转染293T细胞,建立过表达IFITM1, IFITM2, IFITM3的293T细胞,然后用上述包装出的vsv-g’漫病毒分别感染过表达IFITM1, IFITM2, IFITM3蛋白的293T细胞,通过western-blot试验检测vsv-g假病毒感染细胞后,表达标志蛋白EgFP的情况,从而确定IFITM1, IFITM2, IFITM3蛋白对vsv-g假病毒的抑制效果。通过以上方法,本实验成功从293T细胞中克隆出ifitml, ifitm2, ifitm3三段目的基因,基因片度约400bp左右,并将三段目的基因连接到pMD18-T载体上,经测序结果显示正确,证明目的基因克隆成功,进一步将目的基因连接到pVAX1载体中,经酶切鉴定,目的基因和载体片段显示完全正确,证明分别含有ifitm1, ifitm2, ifitm3基因的重组质粒pV-IFITM1, pV-IFITM2, pV-IFITM3构建成功,转染293T细胞后能够在真核细胞中表达目的蛋白,并且在研究中我们发现,过表达IFITM2、IFITM3蛋白的293T细胞比没有过表达IFITM2、IFITM3蛋白的细胞的抗vsv-g慢病毒感染的能力比较明显,但过表达IFITM1蛋白的293T细胞与没有过表达IFITM1蛋白的细胞的抗vsv-g慢病毒感染的能力无明显变化,说明IFITM蛋白家族的IFITM2和IFITM3蛋白对vsv-g慢病毒的感染具有一定的直接或间接的抑制作用,但IFITM1对vsv-g假病毒的抑制效果不明显,但是,有文献报道,IFITM1对肿瘤的生长具有一定的一种效果,当然这也是我们未来的一个研究方向,以及进一步探索有关IFITM蛋白家族的抗病机理及生物学功能。

关键词： IFITM1 IFITM2 IFITM3 vsv-g 抗病毒

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