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Aurone derivatives as vps34 inhibitors that modulate autophagy

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Acta Pharmaceutica Sinica B 2019年第3期9卷 537-544页

作者： Guodong Li Joshua William Boyle Chung-Nga Ko Wu Zeng Vincent Kam Wai Wong Jian-Bo Wan Philip Wai Hong Chan Dik-Lung Ma Chung-Hang Leung State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine Institute of Chinese Medical SciencesUniversity of MacaoMacao999078China School of Chemistry Monash UniversityClayton3800Australia Department of Chemistry Hong Kong Baptist UniversityHong Kong999077China State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine Macao University of Science and TechnologyMacao999078China Department of Chemistry University of WarwickCoventry CV47ALUK

We report in this study the identification of a natural product-like antagonist(1a) of vps34 as a potent autophagy modulator via structure-based virtual screening. Aurone derivative 1a strongly inhibited vps34 activity in cell-free and cell-based assays. Significantly, 1a prevents autophagy in human cells induced either by starvation or by an mT OR inhibitor. In silico modeling and kinetic data revealed that 1a could function as an ATP-competitive inhibitor of vps34. Moreover, it suppressed autophagy in vivo and without inducing heart or liver damage in mice. 1a could be utilized as a new motif for more selective and efficacious antagonists of vps34 for the potential treatment of autophagy-related human diseases.

关键词： Autophagy Natural products vps34 Inhibitor Structure-based virtual screening Vesicle trafficking Heart or liver damage Aurone derivative

Ubiquitination status does not affect vps34 degradation

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Genes & Diseases 2020年第3期7卷 401-407页

作者： Jing Tang Fei Sun Xiao-Juan Deng Yuan-Lin Ma Kun-Yi Li Ying Tang Guo-Jun Chen Department of Neurology The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical UniversityChongqing Key Laboratory of Neurology1 Youyi RoadChongqing 400016China Department of Physiology Wayne State University School of MedicineDetroitMI48201USA

vps34(vacuolar protein-sorting 34)plays important role in autophagy and endosomal trafficking.These processes are closely associated protein ubiquitination and degradation.We have hypothesized that vps34 ubiquitination status would also control its degradation.Here,we report that our results did not support this assumption.In cells transiently transfected with ubiquitin(UB)constructs contained different lysine residues(Ks),vps34 ubiquitination could occur regardless of the presence of any Ks in UB.However,vps34 protein levels were not significantly altered in cells transiently transfected with these UB mutants.We further found that vps34 protein was altered by pharmacological manipulation of E2/E3 activity;yet this effect was not significantly affected by UB overexpression.In vivo experiments revealed that in APP/PS1 mice,an animal model of Alzheimer’s disease(AD),although ubiquitination of vps34 was significantly reduced,vps34 protein levels remained unchanged.vps34 indeed was subjected to proteasomal or lysosomal degradation,as prolonged treatment of proteasomal inhibitor MG132 or lysosomal inhibitor chloroquine elevated vps34 protein levels.We conclude that unlike most of other proteins,vps34 ubiquitination is not closely associated with its degradation.

关键词： Alzheimer’s disease Degradation Ubiquitination UPS vps34

Beclin 1-vps34 complex architecture： Understanding the nuts and bolts of therapeutic targets

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Frontiers in Biology 2015年第5期10卷 398-426页

作者： Deanna H. Morris Calvin K. Yip Yi Shi Brian T. Chait Qing Jun Wang Department of Molecular and Cellular Biochemistry University of Kentucky Lexington KY 40536 USA Department of Biochemistry and Molecular Biology The University of British Columbia Vancouver BC V6TIZ3 Canada Laboratory of Mass Spectrometry and Gaseous Ion Chemistry The Rockefeller University New York NY 10065 USA Department of Toxicology and Cancer Biology University of Kentucky Lexington KY 40536 USA Markey Cancer Center University of Kentucky Lexington KY 40536 USA

Autophagy is an important lysosomal degradation pathway that aids in the maintenance of cellular homeostasis by breaking down and recycling intracellular contents. Dysregulation of autophagy is linked to a growing number of human diseases. The Beclin 1-vps34 protein-protein interaction network is critical for autophagy regulation and is therefore essential to cellular integrity. Manipulation of autophagy, in particular via modulation of the action of the Beclin I-vps34 complexes, is considered a promising route to combat autophagy-related diseases. Here we summarize recent findings on the core components and structural architecture of the Beclin 1-vps34 complexes, and how these findings provide valuable insights into the molecular mechanisms that underlie the multiple functions of these complexes and for devising therapeutic strategies.

关键词： Beclin 1 vps34 Nrbf2 complex structure CX-MS EM inhibitor drag design

Beclin1通过PI3KⅢ/vps34信号通路调控血管平滑肌细胞增殖与凋亡

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Beclin1通过PI3KⅢ/Vps34信号通路调控血管平滑肌细胞增殖与凋亡

作者：郑旭辉广西医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨Tat-beclin1通过调控Beclin1表达水平对主动脉平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)的增殖、凋亡的影响,以及该影响是否经由PI3KⅢ/vps34信号通路实现。方法:培养原代大鼠主动脉平滑肌细胞,用四甲基偶氮唑盐(MTT)... 详细信息

目的:探讨Tat-beclin1通过调控Beclin1表达水平对主动脉平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)的增殖、凋亡的影响,以及该影响是否经由PI3KⅢ/vps34信号通路实现。方法:培养原代大鼠主动脉平滑肌细胞,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度的药物对细胞活性的影响并选择最适药物浓度用于本研究。将VSMCs随机分为六组,空白对照组、Tat-Beclin1肽组(50μmol/L)、Beclin1-sh RNA组、3-MA抑制组(5mmol/L)、Tat-Beclin1肽(50μmol/L)+3-MA(5mmol/L)组及雷帕霉素(Rapamycin,20nmol/L)组,分别采用蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)以及实时反转录聚合酶链式反应(realtime reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)法测定大鼠主动脉平滑肌细胞中Beclin1,vps34的蛋白和mRNA的表达变化。使用共聚焦显微镜观察自噬标志颗粒mcherry-GFP-LC3颗粒。采用Annexin V-FITC/PI流式凋亡检测试剂盒检测VSMCs凋亡率的变化。采用Ed U法检测细胞增殖率。结果:(1)由Western blot结果表明,与对照组(0.59±0.23)相比,Tatbeclin1组Beclin1蛋白(1.21±0.28,Pvps34蛋白(0.70±0.10,Pvps34蛋白(0.70±0.10,Pvps34信号通路调控血管平滑肌细胞增殖与凋亡,上调Beclin1可以促进VSMCs凋亡,抑制其增殖。2.Tat-Beclin1调控VSMCs增殖与凋亡的作用不劣于rapamycin。

关键词： Beclin1 雷帕霉素 vps34 血管平滑肌细胞

vps34泛素化机制研究及其与阿尔兹海默病关系探讨

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VPS34泛素化机制研究及其与阿尔兹海默病关系探讨

作者：汤静重庆医科大学

学位级别：硕士

vps34(Vacuolar protein-sorting 34)在自噬和内体转运中发挥了重要的作用。在AD患者脑组织及其病理模型鼠APP/PS1小鼠脑组织中,vps34激酶活性降低,并且vps34会影响APP内吞转运。提示vps34与AD发病机制有关。我们推测vps34泛素化会改变... 详细信息

vps34(Vacuolar protein-sorting 34)在自噬和内体转运中发挥了重要的作用。在AD患者脑组织及其病理模型鼠APP/PS1小鼠脑组织中,vps34激酶活性降低,并且vps34会影响APP内吞转运。提示vps34与AD发病机制有关。我们推测vps34泛素化会改变其蛋白水平。但是,我们研究发现vps34泛素化并不影响其蛋白水平。使用泛素野生型质粒及其各位点突变质粒与vps34瞬时共转染HEK293细胞,发现vps34可以发生各种类型的多聚泛素化修饰。泛素野生型及各突变位点质粒转染HEK393细胞,内源性vps34蛋白水平没有改变。并且,我们发现vps34既可以通过蛋白酶体也可以溶酶体途径降解,使用蛋白酶体抑制剂MG132或溶酶体抑制剂氯喹的干预下,vps34蛋白水平在12和18小时没有改变,但在24小时明显升高,表明vps34在18小时内相对稳定。在6、12月龄APP/PS1小鼠脑组织中,vps34蛋白水平保持不变,但是vps34的泛素化水平明显降低,表明vps34的泛素化和蛋白水平的改变在APP/PS1小鼠中不一致。这些结果表明vps34泛素化修饰不改变其蛋白水平。

关键词：阿尔茨海默 vps34 泛素化蛋白质降解

利用CRISPR/Cas9技术构建vps34基因敲除的A549/293T细胞系

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中国细胞生物学学报 2018年第10期40卷 1719-1726页

作者：刘玉兰李娅慧张宜娜刘斐胡伯里周继勇南京农业大学动物医学院南京210095 浙江大学动物科学学院杭州310058

该研究利用CRISPR/Cas9策略构建敲除vps34基因的A549/293T细胞系,并初步将其用于自噬功能研究。应用在线工具设计了针对vps34基因的3条sgRNA,并克隆至pX459载体。将重组质粒转染A549/293T细胞,嘌呤霉素初步筛选,通过PCR后测序和Western ... 详细信息

该研究利用CRISPR/Cas9策略构建敲除vps34基因的A549/293T细胞系,并初步将其用于自噬功能研究。应用在线工具设计了针对vps34基因的3条sgRNA,并克隆至pX459载体。将重组质粒转染A549/293T细胞,嘌呤霉素初步筛选,通过PCR后测序和Western blot技术检测发现, sgRNA-1的敲除效果最好。将转染sgRNA-1的两种细胞单克隆化, PCR测序发现,存在碱基缺失, Western blot结果显示,对应的单克隆也未检测到vps34蛋白,可见成功获得了vps34敲除的A549/293T细胞系。由于vps34参与自噬起始,实验结果显示, vps34敲除后, LC3-I向LC3-II转化显著被抑制,自噬底物P62大量累积。结果表明,该方法成功获得稳定敲除vps34基因的A549/293T细胞系,且细胞中的自噬被显著抑制。同时,敲除vps34能够降低人肺癌A549细胞的生长速率。该实验利用CRISPR/Cas9系统首次获得稳定敲除vps34基因的哺乳动物细胞A549/293T细胞系,为后续自噬功能研究提供有力工具。

关键词： CRISPR/Cas9系统 vps34 基因敲除单克隆细胞自噬

酿酒酵母中vps8通过vps34调控细胞自噬的机制探讨

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酿酒酵母中Vps8通过Vps34调控细胞自噬的机制探讨

甘氨酸脱羧酶对肝癌细胞自噬和生物学功能的初步研究

2014年第七届中国模式真菌研讨会

作者：陈永谢志平梁永恒南京农业大学生命科学学院南开大学医学院

vps34是酿酒酵母中唯一的磷脂酰肌醇三磷酸激酶(PI3K),通过产生磷脂酰肌醇三磷酸(PI3P)调控细胞内的多种生理过程,如内吞运输,液泡蛋白分选及细胞自噬等。已报道小G蛋白vps21的激活因子vps9影响胞内PI3P的水平。我们的研究发现vps9、Vp... 详细信息

vps34是酿酒酵母中唯一的磷脂酰肌醇三磷酸激酶(PI3K),通过产生磷脂酰肌醇三磷酸(PI3P)调控细胞内的多种生理过程,如内吞运输,液泡蛋白分选及细胞自噬等。已报道小G蛋白vps21的激活因子vps9影响胞内PI3P的水平。我们的研究发现vps9、vps21和vps8所在的模块调控细胞自噬,且vps21模块蛋白缺失显著影响vps34的胞内定位,使得vps34不能正确定位到内体及自噬体装配位点PALS上。为了进一步探讨vps21所在模块是否通过vps34调控细胞自噬,我们检测了vps21模块蛋白与vps34之间的相互关系。酵母双杂交结果显示,vps34只与vps8有互作,而与vps21和vps9没有互作,且vps34与vps8的互作可通过BiFC方法得到验证。进一步分析发现vps8的一些结构域是与vps34互作及维持vps34的胞内定位所必需的,因为只有这些结构域存在时方能与vps34互作及恢复因vps8缺失所导致的vps34错误定位。这些结果表明,vps8极有可能通过与vps34互作调控vps34的定位,从而调控内吞运输及细胞自噬,而vps8的功能也受到vps9激活vps21的影响。

关键词： PI3K vps34 vps21 vps8 vps9

来源： cnki会议评论

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甘氨酸脱羧酶对肝癌细胞自噬和生物学功能的初步研究

作者：董浩山东大学

学位级别：硕士

研究背景与目的肝细胞肝癌是一种高致死率的原发性肝癌。据2022年癌症统计数据显示,中国肝癌的发病率在恶性肿瘤中排第四位,而死亡率则高居第二位。手术切除仍然是根治原发性肝癌的主要手段。然而,大部分肝癌患者确诊时已处于中晚期,恶... 详细信息

研究背景与目的肝细胞肝癌是一种高致死率的原发性肝癌。据2022年癌症统计数据显示,中国肝癌的发病率在恶性肿瘤中排第四位,而死亡率则高居第二位。手术切除仍然是根治原发性肝癌的主要手段。然而,大部分肝癌患者确诊时已处于中晚期,恶性程度高,丧失了手术切除的机会。近年来,特异性高和副作用小的靶向疗法逐渐成为抗肝癌治疗的重要手段之一。目前,临床上治疗肝癌的一线靶向药物只有索拉非尼和仑伐替尼。肝癌错综复杂的生物学机制导致靶向药物面临着响应率低和耐药等问题。因此,亟需详细阐明肝癌发生发展的分子机制,探寻新的药物作用靶标。甘氨酸的分解代谢增加一碳单位的供应和核苷酸的生成,与肿瘤细胞的快速增殖密切相关。甘氨酸脱羧酶(Glycine decarboxylase,GLDC)是甘氨酸分解代谢的关键限速酶。GLDC在多种肿瘤细胞中异常表达并调控癌症的发生发展。GLDC调控嘧啶合成和糖酵解促进非小细胞肺癌的发生。mTOR介导的GLDC乙酰化修饰导致GLDC的酶活受损和降解,进而抑制神经胶质细胞瘤的进展。此外,GLDC调控细胞骨架蛋白cofilin的降解从而抑制肝癌转移。因此GLDC在肿瘤进程中发挥促癌还是抑癌作用与肿瘤所处的微环境有关。由于肝癌的异质性,GLDC调控肝癌自噬和增殖的作用机制尚不明确。本论文通过生物信息学分析GLDC在肝癌患者组织中的表达水平以及临床预后的相关性;构建GLDC过表达和敲低的肝癌细胞系,并在细胞水平上研究GLDC对肝癌细胞增殖、迁移、衰老和自噬等生物学功能的影响;高通量RNA测序分析GLDC调控的下游信号通路;免疫共沉淀实验揭示GLDC结合vps34诱导自噬的分子机制;裸鼠移植瘤模型探究GLDC对体内肝癌细胞成瘤能力的影响。研究方法1.生物信息学分析TCGA数据库中肝癌患者的GLDC表达水平,以及GLDC表达与肝癌患者预后的相关性;2.在Huh7,HepG2和Hep3B肝癌细胞中利用慢病毒感染构建稳定敲低GLDC的细胞系,在Huh7细胞中构建过表达GLDC的细胞系,经Western Blot实验确定GLDC敲低和过表达的效率;利用CCK-8法、平板克隆实验及软琼脂克隆形成实验和β-半乳糖苷酶染色法检测GLDC对肝癌细胞增殖和衰老的影响;3.利用细胞划痕及Transwell迁移实验检测GLDC对肝癌细胞迁移能力的影响,并通过qRT-PCR及Western Blot实验检测GLDC对上皮-间质转化标志分子表达的影响;4.应用JC-1线粒体膜电位荧光探针实验、Western Blot和免疫荧光实验检测GLDC对线粒体膜电位和细胞自噬的影响;5.通过高通量RNA测序分析和qRT-PCR实验,确认GLDC调控的下游靶基因和信号通路;6.通过免疫共沉淀实验检测GLDC结合的自噬相关蛋白,并通过GLDC分段及GLDC乙酰化进一步确认其相互作用;7.利用免疫共沉淀实验检测GLDC对vps34自噬复合体蛋白间相互作用的影响;8.在裸鼠移植瘤模型中检测过表达GLDC对Huh7细胞肿瘤形成能力的影响。研究结果1.GLDC在肝癌组织中呈现低表达,并与患者不良预后相关利用TCGA数据库对GLDC在肝癌的表达及总体生存率进行分析,结果显示与正常组织相比,GLDC在肝癌患者组织中的表达显著降低,且较低的GLDC表达与患者的不良预后相关。2.GLDC敲低及过表达细胞系效率评价利用Western Blot评估GLDC敲低的Huh7,HepG2和Hep3B细胞系以及GLDC过表达的肝癌细胞系中GLDC的表达,结果显示蛋白水平上GLDC显示明显地敲低及过表达。3.GLDC抑制肝癌细胞增殖并促进细胞衰老与对照组细胞相比,敲低GLDC组Huh7和Hep3B肝癌细胞的增殖活力增强,肿瘤细胞的平板克隆和软琼脂克隆集落数目增加,表明GLDC抑制肝癌细胞增殖作用。此外,与对照组相比,GLDC过表达组β-半乳糖苷酶活性增加,GLDC敲低组β-半乳糖苷酶活性降低,表明GLDC促进细胞衰老。RNA测序和GSEA富集分析显示,GLDC可能调控细胞周期和脂代谢相关信号通路。4.GLDC下调Vimentin表达并抑制肝癌细胞迁移与对照组相比,敲低GLDC组肝癌细胞的迁移数目和迁移率增加,而过表达GLDC组细胞迁移数目降低,表明GLDC抑制肝癌细胞迁移。同时,Western Blot检测结果显示GLDC下调波形蛋白Vimentin的mRNA和蛋白表达水平。表明GLDC可能通过下调Vimentin抑制肝癌细胞迁移。5.GLDC增加肝癌细胞线粒体膜电位并促进细胞自噬与对照组细胞相比,敲低GLDC会减少肝癌细胞的线粒体膜电位。Western Blot和免疫荧光实验显示沉默GLDC下调自噬标志物LC3B-Ⅱ蛋白的表达,表明GLDC促进肝癌细胞的自噬。6.GLDC结合vps34蛋白,并通过影响PI3K复合体的形成调节自噬免疫沉淀实验显示,GLDC与vps34存在明显相互作用,利用去乙酰化酶抑制

关键词： GLDC 肝细胞癌细胞增殖自噬 vps34

Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶复合物与自噬的研究进展

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生物化学与生物物理进展 2012年第3期39卷 210-216页

作者：吴葩许彩民中国医学科学院基础医学研究所生物化学与分子生物学国家重点实验室北京100005

Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶(classⅢPI3K)是以磷脂酰肌醇(PtdIns)为底物催化产生PtdIns3 P的激酶,与多种不同的调节蛋白结合形成Ⅲ型PI3K(PI3KC3)复合物,在自噬及膜泡运输中起重要作用.PI3KC3复合物组成成员PI(3)KC3、p150、Beclin 1、ATG14L... 详细信息

Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶(classⅢPI3K)是以磷脂酰肌醇(PtdIns)为底物催化产生PtdIns3 P的激酶,与多种不同的调节蛋白结合形成Ⅲ型PI3K(PI3KC3)复合物,在自噬及膜泡运输中起重要作用.PI3KC3复合物组成成员PI(3)KC3、p150、Beclin 1、ATG14L、UVRAG、Bif-1和Rubicon在进化上大多具有高度的同源性和保守性,并且与神经系统发育、胸腹腔内脏反位及肿瘤等多种疾病的发生和发展密切相关.

关键词：磷脂酰肌醇3-激酶 PI3KC3复合物 vps34 自噬