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猪轮状病毒地方株JL94株vp6基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

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畜牧兽医学报 2004年第4期35卷 443-448页

作者：陈淑红李一经师东方东北农业大学动物医学院哈尔滨150030

以猪轮状病毒地方分离株JL94株病毒核酸为模板,通过RT-PCR扩增内衣壳蛋白基因vp6cDNA,将其插入克隆载体质粒pMD18-T,并进行测序。从T载体上将vp6基因亚克隆到表达载体质粒pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并利用Ni2+金属螯... 详细信息

以猪轮状病毒地方分离株JL94株病毒核酸为模板,通过RT-PCR扩增内衣壳蛋白基因vp6cDNA,将其插入克隆载体质粒pMD18-T,并进行测序。从T载体上将vp6基因亚克隆到表达载体质粒pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并利用Ni2+金属螯合亲合层析纯化融合蛋白。结果表明,vp6基因全长1356bp,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量可占菌体蛋白的26.5%,在表达的蛋白中,除45ku主要蛋白外,还有几条分子量较小的蛋白表达出来,这些融合蛋白经纯化后均具有良好的反应特异性。

关键词：猪轮状病毒 JL94株 vp6基因基因克隆大肠杆菌基因表达

一种基于vp6基因的A组轮状病毒拷贝数实时荧光定量PCR检测方法的建立

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中国生物制品学杂志 2019年第5期32卷 575-578页

作者：黄蓉蒋鸿超李小曼王明英王美芬孙强明张桢昆明医科大学附属儿童医院云南昆明650000 昆明市儿童医院云南昆明650000 中国医学科学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的建立一种基于vp6基因的A组轮状病毒(rotavirus,RV)拷贝数的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。方法提取病毒液中RV基因组RNA,经RT-PCR扩增vp6基因片段,回收PCR产物克隆至pMD-19T载体,将鉴定正确的阳性菌株常规培养制备标准品质粒,... 详细信息

目的建立一种基于vp6基因的A组轮状病毒(rotavirus,RV)拷贝数的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。方法提取病毒液中RV基因组RNA,经RT-PCR扩增vp6基因片段,回收PCR产物克隆至pMD-19T载体,将鉴定正确的阳性菌株常规培养制备标准品质粒,建立RT-qPCR病毒拷贝数检测方法,以标准品质粒Ct值为横坐标,拷贝数的对数为纵坐标绘制标准曲线,依据标准曲线方程检测样品中RV拷贝数。结果标准品质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;获得RV标准品质粒的标准曲线方程为y=-0. 246 3 x+10. 957,R^2=0. 995 5;原倍及稀释度为1×10^(-3)的样品溶液的RV病毒拷贝数分别为265 319. 903 5、1 682. 228 735 copies/μL。结论建立的RT-qPCR拷贝数检测方法,能在早期快速准确的检测RV,该方法稳定性较好,可据此标准曲线方程对样品中的RV进行绝对定量,为RV研究及临床检查提供了检测工具。

关键词：轮状病毒 vp6基因实时荧光定量PCR 基因拷贝数

牦牛轮状病毒vp6基因序列分析及RT-PCR检测方法的建立与应用

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畜牧兽医学报 2016年第7期47卷 1465-1473页

作者：周芳岳华张斌李凡陈曦汤承西南民族大学生命科学与技术学院/四川省教育厅重大动物疫病防控技术创新团队成都610041

轮状病毒(rotavirus,RV)vp6基因是RV的主要分子检测靶点,但该基因的点突变会影响RV的分子检测。本试验的目的是在研究牦牛RVvp6基因遗传变异的基础上,建立检测牦牛RV的RT-PCR方法并应用于临床样本检测。采用Prime 5.0设计引物,从30个牦... 详细信息

轮状病毒(rotavirus,RV)vp6基因是RV的主要分子检测靶点,但该基因的点突变会影响RV的分子检测。本试验的目的是在研究牦牛RVvp6基因遗传变异的基础上,建立检测牦牛RV的RT-PCR方法并应用于临床样本检测。采用Prime 5.0设计引物,从30个牦牛腹泻样本中扩增得到14个位于931—1 338bp牦牛RVvp6基因片段。序列分析结果发现,与牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV)相比,牦牛RVvp6基因在931—1 110bp间出现多处点突变,而在1 100—1 338bp之间序列高度保守。据此设计检测引物,成功建立了检测牦牛RV的RTPCR方法,具有良好的特异性和稳定性,只扩增出牦牛RV及BRV的特异片段,对其他无关病原无扩增;检测下限为0.45pg·μL^(-1),灵敏性较好。所建立方法对牦牛RV的检出率明显优于现有检测BRV的RT-PCR方法,为牦牛RV病的诊断和流行病学调查提供了可靠的方法;对BRV的检出也与其他方法具有很好的符合率,也可以用于BRV的检测。对234份犊牦牛腹泻粪便样本的RV检出率:西藏为60.00%(36/60)、青海为95.00%(57/60);四川为85.19%(46/54);云南为90.00%(54/60),证明牦牛RV感染是当前导致犊牦牛腹泻的重要原因。

关键词：牦牛轮状病毒 vp6基因点突变 RT-PCR

草鱼呼肠孤病毒vp6蛋白基因植物表达载体的构建

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淡水渔业 2009年第4期39卷 40-44页

作者：周勇范玉顶徐进李艳秋肖艺曾令兵华中农业大学水产学院武汉430070 中国水产科学研究院长江水产研究所湖北荆州434000

以据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)vp6蛋白的全基因序列(GeneBank AF403394)为模板,采用RT-PCR构建了草鱼呼肠孤病毒vp6蛋白基因植物表达载体的构建。结果显示:实验构建的pCR 2.1-vp6重组质粒含有NcoⅠ和BglⅡ酶切位点;pCR 2.1-vp6重组质粒经PC... 详细信息

以据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)vp6蛋白的全基因序列(GeneBank AF403394)为模板,采用RT-PCR构建了草鱼呼肠孤病毒vp6蛋白基因植物表达载体的构建。结果显示:实验构建的pCR 2.1-vp6重组质粒含有NcoⅠ和BglⅡ酶切位点;pCR 2.1-vp6重组质粒经PCR扩增和测序显示含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒vp6基因读码框片段。将目的片段vp6酶切、克隆到携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体pCAMBIA1302中,再经酶切、PCR扩增和序列测定显示,pCAMBIA1302-vp6含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒vp6基因片段,说明已插入植物表达载体pCAMBIA1302绿色荧光蛋白基因前,成功构建了融合表达草鱼呼肠孤病毒vp6蛋白和绿色荧光蛋白的植物表达载体pCAMBIA1302-vp6。

关键词：草鱼呼肠孤病毒 vp6基因植物表达载体构建

猪A组轮状病毒HN2019-01株的分离鉴定及vp6基因序列分析

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河南农业科学 2021年第6期50卷 125-133页

作者：黄正阳陈宇婧黄克冷超粮刘阳坤姚伦广李娜南阳师范学院生命科学与农业工程学院河南南阳473061 河南省畜禽保健品工程技术研究中心河南南阳473061 河南省动物疫病诊断与综合防控工程技术研究中心河南南阳473061

为了解猪轮状病毒(RV)在河南省的流行情况及其分子遗传特征,利用反转录PCR方法,从河南某猪场腹泻样品中扩增得到RV特异性核酸片段,并将腹泻样品利用MA-104细胞进行RV的分离和传代,将分离得到的RV命名为RVA/Pig-wt/HN2019-01。对分离毒株... 详细信息

为了解猪轮状病毒(RV)在河南省的流行情况及其分子遗传特征,利用反转录PCR方法,从河南某猪场腹泻样品中扩增得到RV特异性核酸片段,并将腹泻样品利用MA-104细胞进行RV的分离和传代,将分离得到的RV命名为RVA/Pig-wt/HN2019-01。对分离毒株vp6基因片段的序列测定及生物信息学分析结果表明,分离毒株vp6核苷酸序列与猪源毒株西南株-1C(SWU-1C)相似性最高,病毒分类上同属I5亚群。vp6蛋白全长397个氨基酸,存在4个N糖基化位点和18个潜在磷酸化位点,二级结构主要由α-螺旋组成,三级空间结构与牛轮状病毒RF株vp6蛋白高度相似,且在2个细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗原表位区域的氨基酸序列保守。

关键词：轮状病毒 A组轮状病毒病毒分离 vp6基因序列分析

猪轮状病毒vp6基因的原核表达载体构建和表达

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河南农业科学 2008年第5期37卷 104-106页

作者：张二芹马强王会岩闫明田南阳师范学院生命科学与技术学院河南南阳473061 河南省农业科学院畜牧兽医研究所河南郑州450002 吉林农业大学动物科技学院吉林长春130118 信阳市明港镇农村经济发展中心河南信阳464194

根据已报道的猪轮状病毒vp6基因序列设计了2对引物,利用pGEM-T-Easy-vp6重组质粒为模板,经PCR扩增获得了1 194 bp的产物。将扩增片段分别插入到pET5α和pGEX-4T-2构建表达载体,并分别在大肠杆菌BL21(DE3)Plyss和ER2566中表达。结果表明... 详细信息

根据已报道的猪轮状病毒vp6基因序列设计了2对引物,利用pGEM-T-Easy-vp6重组质粒为模板,经PCR扩增获得了1 194 bp的产物。将扩增片段分别插入到pET5α和pGEX-4T-2构建表达载体,并分别在大肠杆菌BL21(DE3)Plyss和ER2566中表达。结果表明:成功构建了重组质粒,而且该片段在大肠杆菌中也成功表达,获得了大小为44 kD的蛋白。

关键词：猪轮状病毒 vp6基因原核表达

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转猪轮状病毒vp6基因烟草植物的获得

中国兽医学报 2006年第2期26卷 173-174页

作者：张二芹李世访王春凤钱爱东成卓敏吉林农业大学动物科技学院吉林长春130118 中国农业科学院植物保护研究所北京100094

根据G enB ank中轮状病毒vp 6序列设计1对引物,从pGEM-T-vp 6质粒中扩增vp 6 PCR产物。将vp 6克隆到PB I121质粒中,转化根癌农杆菌LBA 4404,挑取阳性菌落的质粒进行酶切鉴定。用叶盘法转化烟草,获得再生苗,用RT-PCR、PCR和PCR-sou ther... 详细信息

根据G enB ank中轮状病毒vp 6序列设计1对引物,从pGEM-T-vp 6质粒中扩增vp 6 PCR产物。将vp 6克隆到PB I121质粒中,转化根癌农杆菌LBA 4404,挑取阳性菌落的质粒进行酶切鉴定。用叶盘法转化烟草,获得再生苗,用RT-PCR、PCR和PCR-sou thern杂交方法进行鉴定,结果表明,vp 6基因已成功地转入烟草中。

关键词：猪轮状病毒 vp6基因根癌农杆菌LBA4404 烟草植物疫苗

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A群猪轮状病毒JS株vp6基因序列分析

黑龙江畜牧兽医 2007年第7期 27-29页

作者：高秀春时洪艳佟有恩吴波平孙东波白兴华陈建飞冯力东北农业大学生命科学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

参考GenBank中发表PRVOSU毒株vp6序列ORF两端保守区，设计1对特异引物，以PRVJS株反转录cDNA为模板，通过PCR方法获得约1．3kb的基因片段，并克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。测序结果表明：获得了vp6的1320bp全基因序列；将其ORF与... 详细信息

参考GenBank中发表PRVOSU毒株vp6序列ORF两端保守区，设计1对特异引物，以PRVJS株反转录cDNA为模板，通过PCR方法获得约1．3kb的基因片段，并克隆到pMD18-T载体中进行序列测定。测序结果表明：获得了vp6的1320bp全基因序列；将其ORF与国内外9株PRVvp6基因的ORF进行核苷酸和氨基酸同源性比较，核苷酸同源性在77．1％～91．1％之间，氨基酸的同源性在89．7％～99．5％之间；在氨基酸系统发育进化树中，JS毒株与A131、OSU、CN86毒株亲缘关系较近．为一个进化群。

关键词： PRV vp6基因序列分析

猪轮状病毒JL94株vp6基因克隆及同源性比较

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中国兽医杂志 2003年第9期39卷 7-9页

作者：陈淑红李一经师东方魏晓军包海鹰东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 内蒙古通辽市科尔沁区畜牧局内蒙古通辽028000

通过反转录—聚合酶链反应 (RT— PCR)扩增了猪轮状病毒国内地方分离株 JL 94的 vp6基因 c DNA片段。将其插入克隆载体质粒 p MD18- T的 Eco RV酶切位点处 ,构建了重组质粒 p MD18- T— vp6。对克隆的 vp6基因进行序列测定 ,测序结果显... 详细信息

通过反转录—聚合酶链反应 (RT— PCR)扩增了猪轮状病毒国内地方分离株 JL 94的 vp6基因 c DNA片段。将其插入克隆载体质粒 p MD18- T的 Eco RV酶切位点处 ,构建了重组质粒 p MD18- T— vp6。对克隆的 vp6基因进行序列测定 ,测序结果显示 vp基因全长 135 6 bp,并与猪 A群轮状病毒 OSU(亚组 )、Gottfried(亚组 )的 vp6进行同源性比较 ,结果显示 ,核苷酸序列同源性分别为 86 .85 %、82 .4 1% ,氨基酸序列同源性分别为 97.4 8%、93.2 0 % ,结果表明 JL 94分离株与

关键词：猪轮状病毒 JL94株 vp6基因基因克隆同源性比较反转录-聚合酶链反应