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蓝舌病1型病毒vp5蛋白的表达及免疫原性分析

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蓝舌病1型病毒VP5蛋白的表达及免疫原性分析

作者：党伟华郑州大学

学位级别：硕士

蓝舌病(Bluetongue,BT)是由蓝舌病毒(Bluetongue virus,BTV)感染引起的一种非接触性传染病。该病被世界动物卫生组织(World Organisation for Animal Health)列为一种必须申报的烈性动物传染病。BTV主要感染羊、牛等反刍动物。BTV通过... 详细信息

蓝舌病(Bluetongue,BT)是由蓝舌病毒(Bluetongue virus,BTV)感染引起的一种非接触性传染病。该病被世界动物卫生组织(World Organisation for Animal Health)列为一种必须申报的烈性动物传染病。BTV主要感染羊、牛等反刍动物。BTV通过库蠓、伊蚊等昆虫在反刍动物之间传播。构成病毒外壳的vp2能够诱导机体产生中和抗体;vp5能够增强由vp2刺激机体产生的中和抗体滴度,可以用于病毒样颗粒的装配和基因工程疫苗的研究。本研究利用原核表达系统表达了BTV1外壳蛋白vp5,又对其免疫原性进行研究,为进一步开展BTV vp5蛋白相关研究奠定了基础。通过构建原核重组质粒pET-28a-vp5,并转化BL21(DE3)感受态细胞。IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE和Western-blot结果表明,重组vp5蛋白分子量约为62kDa,与预期一致。进一步对诱导表达条件进行优化,结果表明用2×YT培养基、在IPTG浓度为0.4mmol/L、温度为25℃、诱导表达6h时重组蛋白可溶性表达量最高。纯化后的重组蛋白vp5分别以40μg/只和20μg/只免疫Balb/c小鼠,同时设置阴性对照。小鼠三免后ELISA检测产生抗体的效价,结果显示效价最高能达到1:2.048×10;Dot-ELISA结果显示vp5抗体能与BTV1病毒发生特异性反应。本研究不仅为分析vp5提高vp2的免疫保护效果的作用机制提供了重要的实验材料,并且为进一步研发多价亚单位疫苗和多肽疫苗奠定了基础。

关键词：蓝舌病病毒 vp5蛋白原核表达抗体

蓝舌病病毒1型vp2、vp5蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

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蓝舌病病毒1型VP2、VP5蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

作者：魏鹏中国农业科学院

学位级别：硕士

蓝舌病(Bluetongue，BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒（BTV）引起的可感染山羊、绵羊、牛、鹿和骆驼等反刍动物的传染病。该病可经媒介昆虫(如库蠓、伊蚊等)传播，病畜以口腔、鼻腔和胃肠道黏膜发生溃疡性炎症变化为特征。BTV... 详细信息

蓝舌病(Bluetongue，BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒（BTV）引起的可感染山羊、绵羊、牛、鹿和骆驼等反刍动物的传染病。该病可经媒介昆虫(如库蠓、伊蚊等)传播，病畜以口腔、鼻腔和胃肠道黏膜发生溃疡性炎症变化为特征。BTV血清型众多，目前已至少存在26个血清型。由于BT各个血清学之间没有交叉保护作用，因此，尽早鉴别诊断爆发的BT血清型并在该病流行区域接种相应的疫苗是防治本病的关键。BTV基因组由10个双股正链RNA组成，10个节段基因编码7种结构蛋白（vp1～vp7）和4种非结构蛋白（NS1、NS2、NS3、NS3a）。其中vp2蛋白和vp5蛋白是BT的血清型特异性抗原。根据Genbank中BTV1L2基因序列（登录号：JN848760.1）和M5基因序列（登录号：JN848763.1）各设计1对引物，从感染BTV1的BHK-21细胞沉淀中提取病毒RNA，经RT-PCR扩增L2基因和M5基因。将这两段基因酶切后分别克隆至pMAL-c4x原核表达载体和pFastBacHTA真核表达载体，分别表达重组的vp2蛋白和vp5蛋白。分别以原核系统表达的vp2蛋白和vp5蛋白免疫4-6周龄的BALB/c小鼠，第3次免疫后测效价，加强免疫后将鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。以真核表达系统表达的重组蛋白为检测抗原，通过间接ELISA方法筛选出4株能稳定分泌抗vp2蛋白单克隆抗体（Monoclonal antibody,Mab）的杂交瘤细胞，分别命名为BTV1vp2-3E8、BTV1vp2-3A7、BTV1vp2-4E2和BTV1vp2-4B6，简称为3E8、3A7、4E2和4B6;筛选出4株能稳定分泌抗vp5蛋白Mab的杂交瘤细胞，分别命名为BTV1vp5-1B9、BTV1vp5-1F3、BTV1vp5-3B6、BTV1vp5-4E10，简称为1B9、1F3、3B6和4E10。Western blot结果表明4株针对BTV1-vp2Mabs和4株针对BTV1-vp5Mabs都可与BTV1在BHK-21细胞中表达的相应蛋白反应，而与对照BHK-21细胞碎片不反应;IFA结果表明3E8、4E2、4B6、1B9都与BTV1发生特异性反应，与其他血清型呈阴性反应，为建立BTV1鉴别诊断方法奠定了基础。此外，3A7、1F3、3B6、4E10与BTV1反应外，这4株单抗还有各自的反应谱系，如3A7还与BTV8反应，1F3还与BTV2、BTV9、BTV18、BTV23反应，3B6还与BTV2、BTV9反应，4E10还与BTV2，BTV18，BTV23反应。利用肽扫描和合成肽的方法，对这几株Mabs所识别的抗原表位进行了鉴定，结果表明，Mab3E8识别的抗原表位为465YGQMINEMI473;Mab4B6识别的抗原表位为115AQPLKVGL122;Mab3A7识别的抗原表位为149SYHVEPIE156;Mab1F3识别的抗原表位为141EIEDEKQFDILNKAVT156;Mab1B9识别的抗原表位为121EKFGKELEEVYNFMNG136;Mab3B6识别的抗原表位为281SVVSTILEYRAKEIPD296;4E10识别的抗原表位为161ILTEEDLQMRRLATAL176。本研究制备的Mabs及所鉴定的抗原表位，为BTV1型特异性检测方法的建立及BTV1vp2、vp5蛋白功能研究提供了基础，对BT的防控具有重要意义。

关键词：蓝舌病病毒1型 vp2蛋白 vp5蛋白单克隆抗体抗原表位

表达蓝舌病病毒vp2，vp5蛋白的重组山羊痘病毒的构建及免疫原性研究

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表达蓝舌病病毒VP2，VP5蛋白的重组山羊痘病毒的构建及免疫原性研...

作者：李浩波南京农业大学

学位级别：硕士

蓝舌病是由蓝舌病病毒引起的反刍动物的出血性疾病,它是OIE规定的多种动物共患病。长久以来有弱毒苗和灭活苗获得了商业化应用。这两种苗存在两个共同问题：无法区别自然感染和免疫过的动物;疫苗保护力具有血清型特异性。为解决上述问题... 详细信息

蓝舌病是由蓝舌病病毒引起的反刍动物的出血性疾病,它是OIE规定的多种动物共患病。长久以来有弱毒苗和灭活苗获得了商业化应用。这两种苗存在两个共同问题：无法区别自然感染和免疫过的动物;疫苗保护力具有血清型特异性。为解决上述问题,本研究利用我国自行培育并得到广泛应用的CPV弱毒株,构建出表达蓝舌病病毒vp2,vp5蛋白的重组山羊痘病毒,并利用PCR鉴定法对重组病毒进行了鉴定,最后使用重组病毒进行了动物试验,检测了其免疫原性,为蓝舌病重组山羊痘疫苗的产业化奠定了基础。该重组疫苗克服了现有疫苗缺陷,为蓝舌病的防控做了充足技术储备,具有极大的实践生产价值。试验一重组质粒的构建根据已发表BTV-12的vp5,vp2基因序列,设计并合成两对引物。利用RT-PCR方法扩增BTV-12型毒株的vp5,vp2基因片段。将扩增片段克隆至pBluescript载体中,随后进行序列测定。经核酸序列测定,获得的基因片段正确。在已有载体ptk-gpt-ires-egfp的基础上,将BTV的保护性抗原vp5、vp2基因片段依次分别克隆至载体的Sall, HindⅢ;Xbal, PstI位点,获得重组质粒pTK-BTV-vp5-vp2。试验二重组病毒rCPV-BTV-vp5-vp2的拯救及鉴定分别用限制性内切酶ApaⅠ及BglⅠ对山羊痘病毒基因组和重组质粒进行酶切消化,随后进行回收。以我国自行培养并得到广泛应用的山羊痘病毒(CPV)疫苗株为亲本病毒,以山羊痘病毒CPV的复制非必需区TK基因为靶点,通过重组质粒与CPV的同源重组,进行脂质体转染,获得目的重组病毒rCPV-BTV-vp5-vp2。试验三表达蓝舌病病毒蛋白的重组山羊痘病毒的初步免疫原性研究以106PFU病毒量的rCPV-BTV-vp5-vp2腹腔接种5只4周龄的BALB/C小鼠,免疫后21天采血分离血清进行病毒中和试验。结果表明,用本研究构建的蓝舌病重组山羊痘病毒rCPV-BTV-vp5-vp2一次免疫BALB/C小鼠,3周后所有免疫小鼠CPV中和抗体全部转阳(40-80);BTV中和抗体转阳率为100%(5/5),滴度分别为80,160,80,40,40。参照OIE BTV弱毒疫苗效力检验合格要求和国外相关文献的报道,本研究获得的重组病毒应该具有对山羊痘病毒和蓝舌病病毒强毒攻击的完全免疫保护作用,为蓝舌病重组山羊痘疫苗的产业化提供参考。

关键词：蓝舌病 vp2蛋白 vp5蛋白山羊痘病毒载体重组疫苗中和抗体

蓝舌病Ⅰ型病毒vp5蛋白的表达纯化及免疫原性分析

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中国动物检疫 2019年第3期36卷 69-74,83页

作者：陈玉梅党伟华刘燕凯周景明刘红亮郭亚楠张改平王爱萍郑州大学生命科学学院河南郑州450000

为分析蓝舌病Ⅰ型病毒(BTV-1)vp5蛋白的免疫原性,本研究构建了载体PET-28a-vp5并转化BL21(DE3),然后进行IPTG诱导表达,以及SDS-PAGE和Western-blot分析。结果显示,重组vp5蛋白相对分子质量约为62 kDa,与预期结果一致。进一步优化条件,发... 详细信息

为分析蓝舌病Ⅰ型病毒(BTV-1)vp5蛋白的免疫原性,本研究构建了载体PET-28a-vp5并转化BL21(DE3),然后进行IPTG诱导表达,以及SDS-PAGE和Western-blot分析。结果显示,重组vp5蛋白相对分子质量约为62 kDa,与预期结果一致。进一步优化条件,发现IPTG为0.2 mmol/L、温度为25℃、诱导6 h时,重组蛋白在上清中表达量最高,通过Ni柱纯化获得的重组蛋白纯度约为75%。将纯化后的重组蛋白vp5分别以40μg/只和20μg/只免疫Balb/c小鼠,同时设置PBS为阴性对照,对三免后血清进行间接ELISA检测,发现高、低剂量免疫小鼠均能产生针对vp5蛋白的特异性抗体。用灭活BTV-1进行DOT-ELISA检测,发现其能与vp5蛋白免疫的小鼠血清发生特异性反应,说明利用大肠杆菌表达的重组蛋白vp5具有良好的免疫特性,这为进一步开展BTV相关研究奠定了基础。

关键词：蓝舌病1型病毒 vp5蛋白蛋白表达蛋白纯化条件优化免疫分析

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传染性法氏囊病病毒vp5蛋白的研究进展

科技视界 2015年第24期 73-74页

作者：尹伟孙启才浙江大学医学院公共技术平台浙江杭州310058 浙江医院七病区骨科浙江杭州310007

传染性法氏囊病是一种严重威胁禽类健康的免疫缺陷性和免疫抑制性疾病,本文对传染性法氏囊病病病毒vp5蛋白的结构、分子学特征、功能学研究进行了阐述,以期对该病的综合防控提供参考。

关键词：传染性法氏囊病病毒 vp5蛋白分子学特征

新疆地区蓝舌病病毒的分离鉴定及编码vp5外壳蛋白的基因序列分析

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草食家畜 2022年第4期 22-26页

作者：马晓菁薛晓波叶锋刘丽娅古丽扎提·塔力甫汗谷文喜易新萍新疆畜牧科学院兽医研究所/新疆畜牧科学院动物临床研究中心乌鲁木齐830002 新疆畜牧科学院畜牧业经济与信息研究所乌鲁木齐830002

对分离的新疆蓝舌病病毒(BTV)株编码vp5蛋白的S6基因序列进行比对分析,旨在了解分离毒株的基因遗传变异及进化关系,以期为新疆地区蓝舌病疫苗研究提供科学依据。本研究对绵羊全血中分离的疑似BTV分离毒株,提取RNA进行NS1-PCR扩增,克隆... 详细信息

对分离的新疆蓝舌病病毒(BTV)株编码vp5蛋白的S6基因序列进行比对分析,旨在了解分离毒株的基因遗传变异及进化关系,以期为新疆地区蓝舌病疫苗研究提供科学依据。本研究对绵羊全血中分离的疑似BTV分离毒株,提取RNA进行NS1-PCR扩增,克隆测序。应用全长cDNA扩增(full-length ampli-fication of cDNAs,FLAC)技术获得S6基因序列,NCBI Blast比对S6基因同源性,MEGA5.0软件绘制进化树,分析BTV新疆分离株与蓝舌病病毒28个血清型S6基因的序列遗传进化关系。结果表明,新疆地区疑似蓝舌病病毒分离株NS1片段与蓝舌病病毒NS1片段序列相似性为98.04%,获得1株蓝舌病病毒。BTV分离株S6基因序列仅与GenBank中BTV strain XJ1407株、BTV strainMNG2/2016株及BTV-18 strain USA2014/FL株的S6基因具有同源性,且同源性均低于90%,分别为88.11%,87.35%以及70.92%。BTV分离株S6基因序列进化关系分析结果表明,分离株与BTV-18血清型在同一进化分支,与BTV-27血清型亲缘关系最近。研究结果为新疆地区蓝舌病疫苗研制提供科学依据。

关键词：蓝舌病 vp5蛋白新疆分离株

基于PiggyBac转座系统构建稳定表达UL19基因的小鼠乳腺癌细胞系

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生物工程学报 2024年

作者：赵晓彤王欣雅刘滨磊胡翰汪洋湖北工业大学生命科学与健康工程学院

为研究溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒（oncolytic herpes simplex virus type 2，oHSV2）主要衣壳蛋白vp5蛋白（由UL19基因编码）调控免疫细胞抗肿瘤的机制。本研究通过PiggyBac转座系统构建了稳定表达vp5蛋白、近红外荧光蛋白(near-infrared fl... 详细信息

为研究溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒（oncolytic herpes simplex virus type 2，oHSV2）主要衣壳蛋白vp5蛋白（由UL19基因编码）调控免疫细胞抗肿瘤的机制。本研究通过PiggyBac转座系统构建了稳定表达vp5蛋白、近红外荧光蛋白(near-infrared fluorescent protein，iRFP）和绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的小鼠乳腺癌细胞4T1-iRFP-vp5-GFP细胞系。通过流式细胞术及免疫印迹法筛选GFP及vp5高表达的单克隆细胞系，检测所构建细胞系中UL19基因表达稳定性。经SYBR Green I实时荧光定量PCR、免疫印迹法检测，连续传代至15代的4T1-iRFP-vp5-GFP细胞中的UL19基因拷贝数及vp5蛋白表达量均显著高于瞬转UL19基因的4T1细胞，证明了UL19基因稳定插入至4T1细胞基因组中。实时无标记动态细胞分析技术（real time cellanalysis，RTCA）监测4T1-iRFP-vp5-GFP细胞显示具有与其亲代细胞4T1相似的生长活性。进一步研究证实，NK92细胞对4T1-iRFP-vp5-GFP细胞的杀伤能力显著高于4T1细胞。本研究为阐述vp5蛋白在4T1细胞中通过HLA-E分子调控包括T细胞、NK细胞在内的免疫细胞发挥抗肿瘤功能奠定了基础。

关键词：溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒 vp5蛋白 PiggyBac转座系统 4T1细胞

传染性囊病病毒vp2蛋白诱导细胞凋亡的研究

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华南农业大学学报 2002年第2期23卷 70-73页

作者：吕英姿曹永长陈峰毕英佐华南农业大学动物科学学院广东广州510642

在体外分别构建了 3种重组表达质粒 :含传染性囊病病毒GZ911株vp2基因的pGvp2、含HK4 6株vp2基因的pHvp2以及含HK4 6株 5’ -端序列 (包括非编码区、vp5和vp2基因 )的pHvp2 +5 .用不同的重组质粒转染原代鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,在转染... 详细信息

在体外分别构建了 3种重组表达质粒 :含传染性囊病病毒GZ911株vp2基因的pGvp2、含HK4 6株vp2基因的pHvp2以及含HK4 6株 5’ -端序列 (包括非编码区、vp5和vp2基因 )的pHvp2 +5 .用不同的重组质粒转染原代鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,在转染后 0、14、38h ,收集对照组和转染组细胞 ,用酶联免疫吸附试验检测CEF中降解DNA量 .结果 ,在 14和 38h ,各组细胞中测得的Dλ 值均为转染pHvp2 +5组最大 ,其次为转染pHvp2、pGvp2的组 ,并都大于其他对照组 ,表明 2个IBDV毒株的vp2蛋白在CEF中表达后都能诱导CEF发生凋亡 ,但不同毒株的vp2蛋白诱导CEF凋亡的能力不同 ;

关键词：传染性囊病病毒 vp2蛋白 vp5蛋白细胞凋亡鸡胚成纤维细胞致病机理

传染性法氏囊病病毒vpP5酵母双杂交诱饵载体的构建及互作宿主细胞蛋白的筛选

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中国家禽 2015年第3期37卷 22-26页

作者：王念张礼洲陈玉明卢珍高立高玉龙王永强高宏雷刘长军崔红玉李凯王笑梅祁小乐中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 江苏省动物重要疫病与人畜共患病协同创新中心江苏扬州225009

vp5蛋白是传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)编码的一种非结构蛋白,在病毒感染、释放、致病性方面起着重要作用。为了研究vp5蛋白与宿主细胞的相互作用,本试验首先将IBDV vp5基因克隆入p GBKT7,构建诱饵载体p G... 详细信息

vp5蛋白是传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)编码的一种非结构蛋白,在病毒感染、释放、致病性方面起着重要作用。为了研究vp5蛋白与宿主细胞的相互作用,本试验首先将IBDV vp5基因克隆入p GBKT7,构建诱饵载体p GBGt vp5,通过自激活试验证明其没有自激活活性,对酵母细胞没有毒性。然后,运用酵母双杂交技术,从鸡胚成纤维细胞(CEF)c DNA文库中筛选与vp5互作蛋白,经初筛、测序和回转验证,获得5个互作宿主细胞蛋白,为进一步深入研究IBDV vp5与宿主互作的效应和机制奠定基础。

关键词：传染性法氏囊病病毒 vp5蛋白酵母双杂交诱饵载体互作蛋白