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VP4基因鉴定非EV71非CoxA16手足口病病原体漏检的研究

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安徽医科大学学报 2014年第9期49卷 1198-1202页

作者：木朝宇庄晓亮赵俊陈敬贤王明丽安徽医科大学微生物学教研室合肥230032 哥伦比亚大学病理与细胞生物学系纽约10032

目的探讨肠道病毒VP4基因通用引物PCR诊断非肠道病毒71型(EV71)非柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)手足口病(HFMD)病毒方案的准确性。方法通过肠道病毒VP4基因通用引物PCR鉴定阜阳地区非EV71非CoxA16HFMD病毒时,显示两例病毒分离株为Sabin-1(... 详细信息

目的探讨肠道病毒VP4基因通用引物PCR诊断非肠道病毒71型(EV71)非柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)手足口病(HFMD)病毒方案的准确性。方法通过肠道病毒VP4基因通用引物PCR鉴定阜阳地区非EV71非CoxA16HFMD病毒时,显示两例病毒分离株为Sabin-1(命名为Fy-01和Fy-02株)。分别采用引物Evp4/Q8和vp1特异性引物对Fy-01和Fy-02分离株进行鉴定。结果采用VP4基因PCR扩增产物测序证实,两例病毒分离株为Sabin-1,而采用Evp4/Q8引物PCR扩增Fy-01分离株却存在异常的扩增条带,PCR扩增产物测序结果为柯萨奇病毒A组10型(CoxA10);将VP4基因PCR产物制备成克隆载体挑选多个单克隆测序结果显示,Fy-01分离株既存在Sabin-1 VP4基因,又存在CoxA10 VP4基因,证实为两种毒株混合感染。结论临床诊断为非EV71非CoxA16 HFMD的病例,如病原学诊断仅采用VP4基因PCR产物测序,特别是针对多种肠道病毒混合感染引起的HFMD,其结果并不完全可靠。

关键词：手足口病 VP4基因 Sabin-1 CoxA1O

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转移猪轮状病毒VP4基因玉米植株的获得

中国兽医学报 2012年第6期32卷 828-832页

作者：姜岩王丕武吉林农业大学农学院吉林长春130118

根据GenBank中猪轮状病毒VP4基因序列设计引物,从重组克隆载体pMD18-T-vp4中PCR扩增VP4基因,将其插入到植物表达载体pCAMBIA3301中CaMV35S启动子下游,构建成高效植物表达载体pCAMBIA3301-vp4;然后利用农杆菌介导法,以玉米自交系H99茎尖... 详细信息

根据GenBank中猪轮状病毒VP4基因序列设计引物,从重组克隆载体pMD18-T-vp4中PCR扩增VP4基因,将其插入到植物表达载体pCAMBIA3301中CaMV35S启动子下游,构建成高效植物表达载体pCAMBIA3301-vp4;然后利用农杆菌介导法,以玉米自交系H99茎尖来源的玉米愈伤组织为材料,将pCAMBIA3301-vp4导入其中,分化诱导获得再生苗后,对其进行PCR、Southern杂交和RT-PCR检测。结果表明,外源目的基因vp4已成功地转入玉米基因组中,并且目的基因能在转基因玉米植株中获得转录。

关键词：猪轮状病毒 VP4基因玉米植物疫苗

鸡传染性法氏囊病病毒PCR检测及VP4基因序列分析

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动物医学进展 2013年第7期34卷 62-65页

作者：吴忆春滨州职业学院生物工程学院山东滨州256603

从滨州地区某养鸡场疑似鸡传染性法氏囊病病鸡初步分离到一株记为HSJ12分离株的IBDV毒株,从该分离株中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增VP4基因。结果表明,测序结果与GenBank中报道的IBDV vp4序列同源性在95%～99%之间。将VP4基因测序序列... 详细信息

从滨州地区某养鸡场疑似鸡传染性法氏囊病病鸡初步分离到一株记为HSJ12分离株的IBDV毒株,从该分离株中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增VP4基因。结果表明,测序结果与GenBank中报道的IBDV vp4序列同源性在95%～99%之间。将VP4基因测序序列与GenBank上报道的23个序列进行系统遗传进化树分析,证实其与ks株同源性最近,而与23-82、OH株同源性最远。

关键词：传染性法氏囊病病毒 VP4基因克隆和序列分析

口蹄疫病毒vp1、VP4基因核酸疫苗质粒的构建及其免疫原性

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中国生物制品学杂志 2010年第2期23卷 168-171,175页

作者：王晓虎靳玉珠范秀波刘晔张守峰丁壮扈荣良吉林大学畜牧兽医学院长春130062 军事医学科学院军事兽医研究所长春130062 焦作市畜产品质量安全检测中心河南焦作454003 抚顺市兽药饲料监察所辽宁抚顺113000

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)vp1、VP4基因核酸疫苗质粒,并研究其免疫原性。方法通过RT-PCR获得FMDVvp1、VP4基因,以真核表达载体pIRESneo为基础,构建vp1单表达以及vp1、vp4融合表达和共表达质粒。转染BHK-21细胞后,Western blot检测目的... 详细信息

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)vp1、VP4基因核酸疫苗质粒,并研究其免疫原性。方法通过RT-PCR获得FMDVvp1、VP4基因,以真核表达载体pIRESneo为基础,构建vp1单表达以及vp1、vp4融合表达和共表达质粒。转染BHK-21细胞后,Western blot检测目的蛋白的表达。将上述3种基因核酸疫苗、vp1单表达与vp4单表达联合疫苗、灭活疫苗和空载体对照免疫豚鼠,检测血清特异性抗体及中和抗体水平,并进行保护力试验。结果vp1单表达,vp1、vp4融合表达及共表达质粒经PCR及酶切鉴定,证明构建正确。各组核酸疫苗质粒均能诱导产生中和抗体,且具有一定的保护效力。vp1单表达组和联合组保护率均为28.6%;共表达组和融合表达组保护率均为42.9%;灭活疫苗组保护率为100%;空载体组保护率为0。结论口蹄疫病毒vp1与vp4共存时能发挥更好的免疫原性。

关键词：口蹄疫病毒 vp1基因 VP4基因核酸疫苗免疫原性

口服猪A组轮状病毒VP4基因工程乳酸菌对BALB/c小鼠的免疫保护作用

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中国兽医学报 2010年第7期30卷 869-872页

作者：叶丽萍郝凤奇王春凤杨桂连吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118

将轮状病毒pW425et-vp4乳酸菌重组质粒口服免疫BALB/c小鼠,免疫后不同时间眼球采血脱臼处死,收集小鼠血清、脾细胞及肠道内容物,用ELISA方法检测血清IgG水平,用试剂盒检测肠黏膜SIgA水平,以流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群和CD... 详细信息

将轮状病毒pW425et-vp4乳酸菌重组质粒口服免疫BALB/c小鼠,免疫后不同时间眼球采血脱臼处死,收集小鼠血清、脾细胞及肠道内容物,用ELISA方法检测血清IgG水平,用试剂盒检测肠黏膜SIgA水平,以流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群和CD19+B细胞亚群的变化情况,最后进行攻毒试验。结果显示,pW425et-VP4基因工程乳酸菌口服免疫小鼠血清IgG及肠黏膜SIgA水平较对照组有明显差异,且S/N>2.0,CD4+/CD8+比值显著高于对照组,且比值大于2:1;表明猪A组轮状病毒VP4基因工程乳酸菌重组表达质粒可以增强小鼠机体免疫保护能力。

关键词：轮状病毒 VP4基因乳酸菌 BALB/c小鼠免疫保护作用

牛轮状病毒VP4基因RT-qPCR检测方法的建立

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甘肃畜牧兽医 2020年第11期50卷 51-55,61页

作者：拜小强耿金静白生菊魏锁成李琼毅西北民族大学生命科学与工程学院甘肃兰州730030 西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室甘肃兰州730030

旨在建立快速特异的牛轮状病毒(BRV)实时荧光定量PCR检测方法,用于病原初步筛查。首先以BRV vp4作为目的基因,通过查询Genbank设计合成引物,然后将扩增的VP4基因片段克隆至pMD 18-T载体中,构建重组质粒标准品,最后经优化反应条件,建立... 详细信息

旨在建立快速特异的牛轮状病毒(BRV)实时荧光定量PCR检测方法,用于病原初步筛查。首先以BRV vp4作为目的基因,通过查询Genbank设计合成引物,然后将扩增的VP4基因片段克隆至pMD 18-T载体中,构建重组质粒标准品,最后经优化反应条件,建立了最低检测量可达7.21 copies/μl的EvaGreen荧光定量检测方法。经验证,该方法特异性好,对牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒及牛结核分枝杆菌的检测结果均为阴性;重复性较强,组内重复和组间重复变异系数分别为0.95%~1.12%和1.55%~2.18%。此外,利用该方法检测了21份ELISA阳性样本,测得阳性符合率为90.47%。本研究建立的BVR vp4 RT-qPCR检测方法特异、敏感、可重复,可用于病原的快速检测,为BRV临床诊断提供了一种高效、可靠的检测方法。

关键词：牛轮状病毒 VP4基因实时荧光定量PCR

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口蹄疫病毒结构蛋白VP4基因的真核表达

口蹄疫病毒结构蛋白VP4基因的真核表达

作者：王若河北农业大学

学位级别：硕士

口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（FMD virus, FMDV）感染偶蹄动物所引起的一种急性、热性和传播极为迅速的接触性传染病。严重危害家畜的生产力和畜产品质量,不仅给畜牧业生产和进出口贸易造成了很大的经济损失,... 详细信息

口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（FMD virus, FMDV）感染偶蹄动物所引起的一种急性、热性和传播极为迅速的接触性传染病。严重危害家畜的生产力和畜产品质量,不仅给畜牧业生产和进出口贸易造成了很大的经济损失,而且直接威胁人类的食品安全、国际贸易和国家形象,因而被世界动物卫生组织（OIE）列为A类动物传染病,并受到世界各地人们的普遍关注。目前,针对预防口蹄疫疾病的爆发和流行,多数发展中国家主要采用注射灭活口蹄疫病毒疫苗的方法。但灭活疫苗存在灭活不彻底和保护期短等缺点。因此,新型口蹄疫疫苗及免疫策略的研究已成为亟待解决的焦点问题。口蹄疫病毒衣壳由4种结构蛋白vp1, vp2, vp3, vp4各60个拷贝组成,一种抗Asia I型口蹄疫病毒的多肽疫苗,其特征在于由AsiaⅠ型口蹄疫病毒vp1和vp4上B细胞表位、T细胞表位氨基酸的DNA序列串联单独编码表位蛋白,或与载体大分子相连编码表位融合蛋白而获得,其中B细胞表位采用AsiaⅠ型口蹄疫病毒结构蛋白vp1 80～101、133～160和200～213位氨基酸,T细胞表位包括AsiaⅠ型vp4 20～34位氨基酸或vp1 20～34和35～48位氨基酸。本实验以质粒pUC57-vp4为模板,经过EcoRI和BamHI双酶切鉴定和基因序列测定得到FMDV的VP4基因,对目的基因和真核表达载体pcDNA3.1（+）分别以相同的限制性酶EcoRI和BamHI消化后,经T4连接酶连接构建重组质粒,转化宿主菌大肠杆菌DH5α后得到重组质粒pcDNA3.1-vp4,经酶切鉴定正确后,对重组质粒pcDNA3.1-vp4进行测序。结果表明,VP4基因定向克隆到表达载体pcDNA3.1中。将VP4基因与GenBank发表的序列进行同源性比较,证明本研究所用毒株与Foot-and-mouth disease virus O isolate O/NYOO基因编码序列（NCBI登录号分别为AY333431.1）同源性最高,可达100%。结果证明pcDNA3.1-vp4重组质粒构建成功。为鉴定pcDNA3.1-VP4基因能否在真核细胞中表达,本研究用重组质粒pcDNA3.1-vp4转染HeLa细胞,同时用空载体转染HeLa细胞作为阴性对照。SDS-PAGE检测结果显示,在分子量约为8 kD处有一条明显的蛋白条带,而空载体在相应位置未见蛋白条带。结果证明质粒构建成功并可在体外表达vp4蛋白,这为进一步用vp4作为结构蛋白疫苗抗原研究、以及探索可能的疫苗抗原修饰和佐剂筛选奠定了坚实的基础。

关键词：口蹄疫病毒 VP4基因真核表达细胞转染 HeLa细胞

草鱼呼肠孤病毒096 VP4基因生物信息学分析及其在肾细胞中的表达

同方学位论文库评论

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广东海洋大学学报 2015年第4期35卷 56-62页

作者：闫秀英郭定利郑树城王雅谢吉国简纪常吴灶和广东海洋大学水产学院广东湛江524088 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨水产经济动物病害控制广东普通高校重点实验室广东湛江524088 上海海洋大学水产与生命学院上海201306 北京市大兴区水产技术推广站北京102600

克隆得一株新分离病毒草鱼呼肠孤病毒(GCRV)096的长为1 981 bp的VP4基因,分析该基因的生物信息及其编码蛋白的特性。生物信息学分析表明,同一基因型GCRV分离株VP4基因间的差异不大,但不同基因型GCRV分离株VP4基因间却存在很大的差异。GC... 详细信息

克隆得一株新分离病毒草鱼呼肠孤病毒(GCRV)096的长为1 981 bp的VP4基因,分析该基因的生物信息及其编码蛋白的特性。生物信息学分析表明,同一基因型GCRV分离株VP4基因间的差异不大,但不同基因型GCRV分离株VP4基因间却存在很大的差异。GCRV 096 vp4蛋白含有多个功能位点、2个跨膜结构域及多个潜在的抗原决定簇。构建p EGFP-N3-vp4真核表达质粒,并转染至草鱼肾(Ctenopharyngodon idellus kidney,CIK)细胞中,经荧光显微镜观察和Western blot鉴定,表明GCRV 096 vp4融合蛋白在CIK细胞中得以成功表达。

关键词：草鱼呼肠孤病毒 VP4基因生物信息学真核表达

农杆菌介导轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化花生的研究

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作物学报 2008年第7期34卷 1285-1289页

作者：刘峰万书波毕玉平闫彩霞李春娟赵晋平单世华山东省花生研究所山东青岛266100 山东省农业科学院高新技术研究中心山东济南250100

选用鲁花14与花育23花生品种,通过农杆菌介导开展了轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化研究,从转化植株中随机选取26株表现Kan抗性植株进行nptII基因的PCR检测,结果有22株能扩增出620bp左右的nptII基因条带,阳性率约为84.62%。提取nptII... 详细信息

选用鲁花14与花育23花生品种,通过农杆菌介导开展了轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化研究,从转化植株中随机选取26株表现Kan抗性植株进行nptII基因的PCR检测,结果有22株能扩增出620bp左右的nptII基因条带,阳性率约为84.62%。提取nptII基因显示为阳性的植株叶片DNA作模板,用VP4基因特异引物进行PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳分析,所有nptII基因阳性的植株均扩增出了约2350bp的特异性条带,而野生型没有。对部分转基因植株进一步进行PCR-Southern杂交和Southern杂交分析,发现转基因植株中出现了阳性杂交信号,表明VP4基因的确已经整合到花生的基因组中,并且是1-2个拷贝。用RT-PCR分析了11株转G1VP4基因的植株,证明插入鲁花14中的VP4基因已经正常转录,利用Westernblot方法检测筛选到的4株转基因花生,分别提取其蛋白,在30kD处出现特异性蛋白条带,这为获得转基因创新种质材料奠定了基础。

关键词：花生子叶遗传转化 VP4基因