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对虾白斑综合症病毒(WSSV)结构蛋白vp28与vp26的功能分析

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中山大学学报（自然科学版） 2006年第4期45卷 83-86页

作者：刘非寸树健杨凯邓百煌杨晓仪吴文言中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室//生物医药中心广东广州510275

对虾白斑综合症病毒(W SSV)结构蛋白功能的研究数据还不多。怎样预测并验证那些新发现的蛋白功能,为实验研究提供理论参考,是功能基因及结构蛋白的研究重点之一。利用生物信息学技术对获得的W SSV相关数据进行分析和归纳。分析数据显示... 详细信息

对虾白斑综合症病毒(W SSV)结构蛋白功能的研究数据还不多。怎样预测并验证那些新发现的蛋白功能,为实验研究提供理论参考,是功能基因及结构蛋白的研究重点之一。利用生物信息学技术对获得的W SSV相关数据进行分析和归纳。分析数据显示结构蛋白vp28与vp26在二级结构和跨膜结构域等方面具有很高的相似度;而且,这两个蛋白与任何已知的蛋白序列没有明显的同源性,但二者的氨基酸序列彼此间具45%的相似性,提示这两个蛋白可能执行相似的生理功能。一个特别设计的细胞吸附实验用于进一步研究W SSV侵染宿主细胞的过程中vp28和vp26所扮演的角色。实验结果显示,两个蛋白均可以与对虾鳃组织来源的细胞发生特异的体外吸附,表明vp28和vp26可能参与W SSV侵染宿主细胞的初始阶段。

关键词： WSSV vp28 vp26 生物信息学细胞吸附

对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28和vp26的毕赤酵母组成型分泌表达

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渔业科学进展 2016年第4期37卷 135-139页

作者：耿小雪王小霞周怡徐玮张文兵麦康森水产动物营养与饲料农业部重点实验室海水养殖教育部重点实验室中国海洋大学水产学院青岛266003

近年来,重组vp28和vp26蛋白作为蛋白亚单位疫苗,在增强对虾抗白斑综合征病毒(WSSV)感染的过程中具有重要作用。本研究根据Gen Bank中WSSV的基因序列设计引物,以WSSV粗提液为模板进行普通PCR扩增,得到vp28和vp26基因,再用引物悬挂法将Ec... 详细信息

近年来,重组vp28和vp26蛋白作为蛋白亚单位疫苗,在增强对虾抗白斑综合征病毒(WSSV)感染的过程中具有重要作用。本研究根据Gen Bank中WSSV的基因序列设计引物,以WSSV粗提液为模板进行普通PCR扩增,得到vp28和vp26基因,再用引物悬挂法将Eco RⅠ和XbaⅠ酶切位点分别添加到vp28和vp26基因的5端和3端。目的基因经双酶切后插入到表达载体p GAPZαA,转化TOP10大肠杆菌,经博莱霉素(Zeocin)抗性筛选阳性重组酵母表达载体。AvrⅡ酶切线性化之后,电击转化X-33毕赤酵母感受态细胞,经Zeocin抗性筛选得到阳性重组酵母。SDS-PAGE电泳分析重组酵母表达上清液的目的蛋白,没有检测到vp28和vp26重组蛋白。随后,采用蛋白质银染法,结果显示,与空载p GAPZαA组相比,vp28和vp26表达上清液组有明显的条带,证明vp28和vp26在毕赤酵母中成功表达,蛋白分子量大小约为32 kDa。

关键词：白斑综合征病毒 vp28 vp26 重组表达毕赤酵母

对虾白斑综合征病毒vp24和vp26原核表达及抗体制备

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动物医学进展 2011年第6期32卷 9-13页

作者：仇知光张颖刘庆慧黄倢青岛农业大学山东青岛266109 中国水产科学研究院黄海水产研究所山东青岛266071

对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是一种对对虾养殖业造成巨大威胁的病毒,目前并没有有效治愈该病毒病的方法。论文将WSSV-vp24与WSSV-vp26的部分序列克隆至表达载体pBAD/gⅢA中,构建重组载体pBAD/gⅢA-vp24、pBAD/g... 详细信息

对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是一种对对虾养殖业造成巨大威胁的病毒,目前并没有有效治愈该病毒病的方法。论文将WSSV-vp24与WSSV-vp26的部分序列克隆至表达载体pBAD/gⅢA中,构建重组载体pBAD/gⅢA-vp24、pBAD/gⅢA-vp26,并转化入大肠埃希菌Top10感受态细胞中。L-阿拉伯糖诱导重组体,Western blot分析表明vp24和vp26获得表达,采用Co2+亲和层析纯化目的蛋白并制备多克隆抗体。ELISA分析表明vp24和vp26多抗效价均为1∶800。

关键词：对虾白斑综合征病毒 vp24 vp26 原核表达多克隆抗体

对虾白斑综合征病毒vp12的原核表达及其与vp24和vp26的相互作用

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动物医学进展 2013年第1期34卷 11-15页

作者：马方方刘庆慧黄倢上海海洋大学上海201306 农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所山东青岛266071

根据GenBank上对虾白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白基因vp12(wsv 432)的序列,设计并合成引物,PCR扩增得到vp12基因,构建重组表达载体pBAD/gⅢ–vp12并转化大肠埃希菌Top 10感受态细胞。基因工程菌株在37℃用L-阿拉伯糖诱导,表达产物经West... 详细信息

根据GenBank上对虾白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白基因vp12(wsv 432)的序列,设计并合成引物,PCR扩增得到vp12基因,构建重组表达载体pBAD/gⅢ–vp12并转化大肠埃希菌Top 10感受态细胞。基因工程菌株在37℃用L-阿拉伯糖诱导,表达产物经Western blot和SDS-PAGE检测显示有与预期大小19ku相符合的目的蛋白。以Co2+亲和层析方法,获得纯化vp12蛋白。采用Far-Western blot结合ELISA方法,分析vp12与WSSV结构蛋白的作用。结果表明,vp12与囊膜蛋白vp24、vp26具有相互作用,该研究对于揭示WSSV分子组装机制,阐明其致病机理具有重要意义。

关键词：对虾白斑综合征病毒 vp12 原核表达 vp24 vp26 相互作用

白斑综合征病毒囊膜蛋白vp26和vp28的原核表达及多克隆抗体的制备

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江苏农业科学 2012年第10期40卷 37-40页

作者：靳芳草陈昊马晓燕李鹏周开亚江苏省生物多样性和生物技术重点实验室/南京师范大学生命科学学院江苏南京210046

对虾白斑综合征病毒(WSSV)是一种能快速繁殖并且传播的致死病原体,在全球范围威胁虾蟹的生存。它感染的宿主范围很广,不仅侵染各种野生及养殖对虾,而且侵染其他水生甲壳类如蟹类、螯虾和龙虾等。vp28、vp26是WSSV病毒粒子的2个主要囊膜... 详细信息

对虾白斑综合征病毒(WSSV)是一种能快速繁殖并且传播的致死病原体,在全球范围威胁虾蟹的生存。它感染的宿主范围很广,不仅侵染各种野生及养殖对虾,而且侵染其他水生甲壳类如蟹类、螯虾和龙虾等。vp28、vp26是WSSV病毒粒子的2个主要囊膜蛋白。本试验成功构建了其原核表达体系,制备了多克隆抗体,为进一步研究对虾白斑综合征病防治措施的免疫试验提供抗体和依据。

关键词： WSSV vp28 vp26 原核表达多克隆抗体

WSSV膜蛋白vp26与核衣壳蛋白vp51相互作用位点的鉴定及低温保存WSSV病毒粒子方法的建立

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WSSV膜蛋白VP26与核衣壳蛋白VP51相互作用位点的鉴定及低温保存WS...

作者：李侃国家海洋局第三海洋研究所

学位级别：硕士

对虾白斑综合症病毒（White spot syndrome virus, WSSV）是一种杆状型的环状双链DNA (dsDNA)病毒。由该病毒引起的对虾大规模死亡已成为影响对虾养殖业发展的主要制约因素。随着研究的不断深入，已对WSSV的结构蛋白有了一定了解。本实... 详细信息

对虾白斑综合症病毒（White spot syndrome virus, WSSV）是一种杆状型的环状双链DNA (dsDNA)病毒。由该病毒引起的对虾大规模死亡已成为影响对虾养殖业发展的主要制约因素。随着研究的不断深入，已对WSSV的结构蛋白有了一定了解。本实验主要包括WSSV膜蛋白vp26与核衣壳蛋白vp51相互作用位点的鉴定以及低温保存WSSV方法的建立两个方面：（1）WSSV膜蛋白vp26核衣壳蛋白vp51之间存在着相互作用，从而将WSSV的囊膜与核衣壳联系起来。为了进一步研究vp26与vp51之间的相互作用，我们通过免疫共沉淀的方法确定了vp26与vp51相互作用的位点。在实验过程中我们设计了一系列vp51突变体并将这些突变体克隆到载体pET28-V5上使vp51突变体融合表达V5标签;同时还将设计的一系列vp26突变体克隆到载体pET-HIS上，使vp26突变体融合表达HIS标签。然后分别将vp51突变体与vp26突变体在*** BL21中共表达，再利用免疫共沉淀技术以及Western Blot进行检测。我们发现在vp26上和vp51发生相互作用的位点主要位于第156位至204位氨基酸而在vp51与vp26发生相互作用的位点位于第141位至180位氨基酸、第261位至350位氨基酸以及第431位至至466位氨基酸。通过对vp26的晶体结构分析进一步推测vp26上与vp51发生相互作用的位点主要位于第174位至182位氨基酸。通过对vp51二级结构以及亲水性的预测分析发现，vp51上与vp26具有相互作用的区域主要是由α螺旋以及无规则卷曲组成。（2）在实验过程中，我们发现纯化的完整病毒在4℃下保存一段时间后开始出现一定程度降解并且不同时间提纯的病毒悬液在感染力上有所差异，为了降低感染实验过程中的误差，我们尝试利用低温保存技术对WSSV病毒进行低温冻存。在实验过程中，我们先将不同浓度梯度（5%至20%）的DMSO或甘油作为保护剂加入到WSSV提取液中，在-80℃冻存15天后，然后通过透射电镜观察冻存病毒粒子的形态。结果显示当使用DMSO做为冻存保护剂时电镜下观察到的完整病毒粒子数量明显比不含任何冻存保护剂的阴性对照组要多，其中以10%浓度为最佳条件;当使用甘油作为冻存保护剂时电镜下只能观察到几个完整病毒，大部分病毒开始出现解聚并且甘油浓度的增加没有起到有效的保护效果。然后我们利用透射电镜观察冻存15天和30天的含10%DMSO的病毒悬液发现完整病毒粒子的数量和形态没有明显差异。同时我们还利用荧光量PCR检测了分别感染冻存15天和30天的病毒的螯虾肌肉组织中24小时内的病毒增殖速度，实验结果显示感染了含10%DMSO的病毒的螯虾体内病毒增殖速度明显比感染阴性对照组的要快并且其增殖速度没有出现随时间减弱的现象。

关键词：对虾白斑综合症病毒 vp51 vp26 低温保存

对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白vp28和vp26与细胞穿膜肽的融合蛋白在毕赤酵母中的组成型表达研究

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对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28和VP26与细胞穿膜肽的融合蛋白在...

作者：耿小雪中国海洋大学

学位级别：硕士

白斑综合征病毒(WSSV)是危害全球对虾养殖业最严重的病原体之一,给对虾养殖带来了巨大危害。虽然目前还没有有效地控制该病毒蔓延的方法,但是随着wssv基因组测序的完成,该病毒结构基因的组成与功能越来越清晰,这为研究病毒侵染对虾细胞... 详细信息

白斑综合征病毒(WSSV)是危害全球对虾养殖业最严重的病原体之一,给对虾养殖带来了巨大危害。虽然目前还没有有效地控制该病毒蔓延的方法,但是随着wssv基因组测序的完成,该病毒结构基因的组成与功能越来越清晰,这为研究病毒侵染对虾细胞的机制奠定了基础。在研究病毒侵染对虾机制的过程中,研究者们发现病毒的某些囊膜蛋白在启动病毒感染的发生或介导病毒的侵入方面起着重要作用,其中vp28和vp26就是两种非常重要的病毒囊膜蛋白。越来越多的研究表明将一些重要的病毒囊膜蛋白导入对虾体内后,能够增强对虾抗WSSV侵染的能力,而这一研究结果促进了wssv蛋白质亚单位疫苗的诞生。然而蛋白亚单位疫苗的本质是蛋白质,在通过口服的方式免疫对虾时,由于无法以蛋白质大分子的形式被吸收,而达不到很好的免疫效果,因此需要寻求能够携带大分子货物穿越细胞膜的载体—细胞穿膜肽(CPPs)的帮助。本研究首先利用毕赤酵母表达系统成功表达了CPPs-GFP的融合蛋白,所选用的CPPs分别是TAT、R9和Penetratin,并证明CPPs可以携带蛋白质GFP(绿色荧光蛋白)活体穿过克氏原螯虾的肠系膜进入到虾体的血液循环中,然后到达各个组织。在此基础上,再次利用毕赤酵母表达系统成功分泌性表达了vp28和vp26与CPPs的融合蛋白,为WSSV蛋白质亚单位疫苗规模化生产提供了基础数据。具体研究内容与结果如下：***-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP融合蛋白在毕赤酵母中成功分泌性表达。首先,提取pTracer-CMV2质粒作为扩增GFP基因的模板,并且根据TAT、 R9和Penetratin的氨基酸序列利用Codon Adaptation Tool软件设计了适合在酵母中表达的核酸序列,通过引物悬挂法将这些核酸序列添加到了GFP基因的5’端。选择表达载体pGAPZαA的EcoRI和XbaⅠ双限制性内切酶酶切位点,因此在目的基因的两端也分别添加了EcoRⅠ和XbaⅠ的核酸序列。然后,将酶切后的目的基因插入到表达载体中,转化TOP10大肠杆菌感受态细胞,经博莱霉素(Zeocin)抗性筛选阳性克隆,通过测序后可知重组表达载体成功构建。其次,重组质粒经限制性内切酶BlnⅠ (AvrⅡ)酶切线性化之后,电击转化毕赤酵母X-33感受态细胞,经Zeocin抗性筛选得到阳性转化子。最后,SDS-PAGE蛋白质电泳检测重组酵母表达上清目的蛋白的表达情况,结果表明本研究成功利用毕赤酵母表达系统表达了GFP、TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP蛋白,分子量大小约在29kDa。2.检测CPPs携带蛋白质分子穿膜的效果。实验室小规模发酵获得GFP、TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP目的蛋白,经冷冻干燥后获得蛋白上清冷冻干粉,接着用PBS配制成10mg/ml的蛋白母液。用克氏原螯虾作为实验动物,活体灌喂等体积等浓度的GFP、TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP的蛋白溶液,同时灌喂等体积的PBS作为阴性对照。灌喂两小时后分别取样鳌虾的中肠、心脏和肌肉组织进行冷冻切片分析,利用荧光倒置显微镜可以观察到,灌喂TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP的蛋白溶液组的鳌虾的肠道、心脏和肌肉可以看到明显的荧光,而灌喂GFP蛋白液的鳌虾仅在肠道中看到微弱的荧光,阴性对照没有观察到任何荧光。***28-TAT/R9、vp26-TAT/R9和GFP-TAT/R9融合蛋白在毕赤酵母中组成型分泌表达。根据Genbank中WSSV的基因序列设计引物,以WSSV粗提液为模板进行普通PCR扩增,得到vp28和vp26基因。同样用引物悬挂法将TAT和R9的核酸序列添加到vp28、vp26和GFP基因的3’端,并且添加EcoRI和XbaI酶切位点。目的基因经过双酶切、与表达载体连接、线性化、转化毕赤酵母和筛选重组酵母这一系列分子克隆操作过程后,成功得到了重组酵母。SDS-PAGE电泳分析毕赤酵母表达上清的目的蛋白,经考马斯亮蓝R-250染色发现GFP-TAT和GFP-R9表达上清有明显条带,蛋白分子量大小在29kDa左右,但是没有检测到vp28-TAT/R9和vp26-TAT/R9重组蛋白的存在。随后,采用更灵敏的蛋白质检测方法—蛋白质银染法,结果发现vp28-TAT/R9和vp26-TAT/R9表达上清组有明显的条带,证明vp28和vp26及其与TAT和R9的融合蛋白在毕赤酵母中成功表达,蛋白分子量大小约为32kDa。

关键词：白斑综合征病毒细胞穿膜肽 vp28 vp26 分泌表达毕赤酵母

凡纳滨对虾热休克蛋白HSP70与对虾白斑综合征病毒vp24和vp26的作用

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凡纳滨对虾热休克蛋白HSP70与对虾白斑综合征病毒VP24和VP26的作用

对虾白班综合征病毒vp136C的原核表达及功能分析

2012年中国水产学会学术年会

作者：孙凡刘庆慧黄倢中国水产科学研究院黄海水产研究所上海海洋大学

为了研究凡纳滨对虾热休克蛋白70（HSP70）在白斑综合征病毒（WSSV）感染中的作用,基于热休克蛋白的结构,将HSP70分为两段HSP70A和HSP70P,分别克隆至表达载体pBAD/gⅢA中,构建的重组载体转入到大肠杆菌Top10感受态细胞中,经L-阿拉伯糖诱... 详细信息

为了研究凡纳滨对虾热休克蛋白70（HSP70）在白斑综合征病毒（WSSV）感染中的作用,基于热休克蛋白的结构,将HSP70分为两段HSP70A和HSP70P,分别克隆至表达载体pBAD/gⅢA中,构建的重组载体转入到大肠杆菌Top10感受态细胞中,经L-阿拉伯糖诱导,采用SDS-PAGE及Westernblot分析,结果表明重组蛋白HSP70A和HSP70P得到表达。经Co2+亲和层析纯化获得电泳纯目的蛋白。Farwestern分析表明,HSP70A和HSP70P与重组表达的vp24、vp26有相互作用,ELISA结果说明在设定浓度范围内,HSP70A和HSP70P与vp24、vp26的作用与浓度成正相关。间接免疫荧光分析表明,HSP70与vp24、vp26共定位于对虾血细胞上。vp24、vp26与HSP70作用减少HSP70的ATP活性。该研究为深入研究HSP70在WSSV感染中的作用提供依据。

关键词： HSP70 vp24 vp26 原核表达相互作用

来源： cnki会议评论

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对虾白班综合征病毒VP136C的原核表达及功能分析