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猪细小病毒变异株ELISA检测方法的建立及血清流行病学初步调查

猪细小病毒变异株ELISA检测方法的建立及血清流行病学初步调查

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作者：孙宗英浙江大学

学位级别：硕士

2006年本实验室在国内首次发现PPV变异株,2007年扩增出三株PPV变异株(本文命名为YW8、YH17、JH13)全长5119bp的序列,并克隆外壳蛋白编码基因vp2-a,构建了重组质粒pET-28a-vp2-a,将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中。本研究用1mmol/L IPTG诱导... 详细信息

2006年本实验室在国内首次发现PPV变异株,2007年扩增出三株PPV变异株(本文命名为YW8、YH17、JH13)全长5119bp的序列,并克隆外壳蛋白编码基因vp2-a,构建了重组质粒pET-28a-vp2-a,将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中。本研究用1mmol/L IPTG诱导表达重组菌,经SDS-PAGE分析,表明vp2-a基因在大肠杆菌中成功表达,表达量占总蛋白的20.4%,表达的目的蛋白分子量约为81 kDa。菌体经大量培养后,经溶菌酶和超声裂解,对以包涵体形式存在的目的蛋白,先后用2M/L尿素和2％TritonX-100洗涤,然后用8M/L尿素溶解包涵体,用镍琼脂糖凝胶FF柱纯化,经SDS-PAGE分析,获得的蛋白纯度达90.2%。将纯化后的目的蛋白进行尿素梯度透析复性,目的蛋白成功获得复性。用纯化复性的vp2-a蛋白作为包被抗原,HRP-兔抗猪酶标抗体为二抗,建立PPV变异株血清抗体的间接ELISA检测方法。通过对抗原包被浓度、抗体稀释倍数、最佳封闭液及各步骤作用时间等试验,最终确定抗原最适包被浓度为1μg/ml,抗体稀释倍数为1：25,酶标二抗稀释倍数为1：2000,最佳封闭液为5%脱脂奶粉,待测血清的反应时间为37℃1h,酶标二抗孵育时间为37℃1.5h,底物作用时间为37℃20min。对5份未吃初乳的新生仔猪阴性血清的测定,确定阴阳性临界值为0.252。阻断试验表明建立的间接ELISA方法对PPV变异株抗体具有很好的特异性,阻断率达60.2%。批内和批间变异系数为2.35-6.05%,表明本方法的重复性良好。利用构建好的间接ELISA方法,对浙江、江苏、上海三个地区16个猪群的503份血清进行检测,结果10个群的161份血清为阳性,总阳性率32%,阳性群平均阳性率47.4%,初步了解了浙江、上海、江苏三个地区PPV变异株的血清流行病学情况。

关键词： PPV变异株 vp2-a蛋白间接ELISA 血清流行病学

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