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猫杯状病毒抗原检测胶体金免疫层析试纸条的研制

猫杯状病毒抗原检测胶体金免疫层析试纸条的研制

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作者：李华斌山西农业大学

学位级别：硕士

猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)是猫的一种重要传染性和地方性病原体,可引起轻微自限性临床症状,包括呼吸系统疾病、口腔炎和口腔炎症综合征;极少数情况下,FCV感染可能会导致急性关节炎、毒性全身性疾病(virulent-systemic disease... 详细信息

猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)是猫的一种重要传染性和地方性病原体,可引起轻微自限性临床症状,包括呼吸系统疾病、口腔炎和口腔炎症综合征;极少数情况下,FCV感染可能会导致急性关节炎、毒性全身性疾病(virulent-systemic disease,VSD)、严重肺炎、流产甚至猝死。目前在欧洲和美国的VSD发生率越来越高,并且在中国也已经出现,FCV感染时多伴随其它病原的感染,诊断较困难,因此建立快速高效检测方法是必要的。FCV是杯状病毒科无囊膜的RNA病毒,基因组包含3个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),ORF2编码FCV的衣壳蛋白vp1,在诱导机体产生免疫应答中起着重要的作用。vp1蛋白分为六个区(A～F),其中vp1-b蛋白高度保守,可以诱导机体产生广谱性抗FCV抗体,适合作为免疫原制备抗FCV单克隆抗体。本试验将疫苗株FCVF9的vp1-b区序列的重组质粒p ET22b(+)-b转化到bL21(DE3)表达菌中,通过IPTG诱导进行表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,结果表明该蛋白为可溶性抗原,大小约为55 k Da,且有良好的反应原性。将纯化后的vp1-b蛋白与弗氏佐剂混匀免疫6～8周龄bALb/c小鼠,选择血清效价较高小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,制备杂交瘤细胞;纯化的FCV-SX1病毒粒子作为包被抗原,建立间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞株系。经3次亚克隆筛选得到3株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为:1E3、3A4和4F11;Westernblot结果表明1E3、3A4、4F11均能识别FCV-SX1、FCV-SX2、FCV CH-JL2,具有良好的反应性;间接ELISA方法对杂交瘤细胞上清及制备的腹水进行抗体效价检测,结果表明1E3、3A4和4F11的细胞上清效价分别为1:1.6×103、1:1.6×103、1:8.0×103,腹水效价分别为1:1.28×106、1:2.56×106、1:1.28×106,其中1E3和3A4为Ig G1,4F11为Ig M。本试验中,选用单抗3A4为金标抗体,单抗4F11作为检测线抗体,羊抗鼠二抗为质检抗体,制备FCV抗原检测胶体金试纸条。用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,经检测3A4与胶体金颗粒结合的最适p H为7.5;进一步优化试验结果表明,金标抗体的最适浓度为7.2μg/m L,检测线包被浓度为1.0 mg/m L,质控线浓度为0.5 mg/m L,样品稀释液选择为PbST。组装的试纸条对4种常见的猫病毒FCV毒株、猫细小病毒毒株(Feline panleukopenia virus,FPV)、猫疱疹病毒毒株(Feline Herpesvirus,FHV)及猫传染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritonitis vrius,FIPV)毒株进行检测,显示特异性良好,与FPV、FHV、FIPV没有交叉反应;试纸条的敏感度为104 TCID50/m L;稳定性试验显示,该试纸条在4℃条件下可以保存6个月。用制备的胶体金试纸条与RT-PCR方法同时对94份猫鼻咽拭子进行检测,符合率为93.6%,符合率在90%以上。综上试验结果表明,本试验研制的胶体金试纸条可以用于猫杯状病毒临床检测。

关键词：猫杯状病毒 vp1-b蛋白单克隆抗体胶体金免疫层析技术试纸条

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