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生物技术通报 2022年第10期38卷 243-253页

作者：沈俊强张莉萍于瑞明王永录潘丽刘霞刘新生甘肃农业大学生命科学技术学院兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730064

分别建立基于猪嵴病毒(PKV)结构蛋白vp0与vp1的间接ELISA检测方法。对PKV结构蛋白vp0与vp1的基因进行合成并连接至原核表达载体pET-32a后,转入感受态细胞BL21中,用IPTG诱导表达的重组蛋白经Ni柱纯化后,分别以重组蛋白pET-32a-vp0与pET-3... 详细信息

分别建立基于猪嵴病毒(PKV)结构蛋白vp0与vp1的间接ELISA检测方法。对PKV结构蛋白vp0与vp1的基因进行合成并连接至原核表达载体pET-32a后,转入感受态细胞BL21中,用IPTG诱导表达的重组蛋白经Ni柱纯化后,分别以重组蛋白pET-32a-vp0与pET-32a-vp1作为包被抗原,采用棋盘滴定法建立两种间接ELISA检测方法,并进行重复性、敏感性、特异性实验和临床检测。结果显示重组蛋白pET-32a-vp0与pET-32a-vp1抗原的最佳包被浓度分别为2 mg/mL和2.5 mg/mL,反应条件均为37℃、1 h;封闭液最佳条件为5%脱脂乳,37℃、2 h;血清最佳孵育条件为1∶200,37℃、1 h;二抗最佳孵育条件分别为1∶20000和1∶15000,37℃、1 h;最佳显色时间为10 min,两种间接ELISA检测方法临界值分别为0.306和0.277。试验结果表明本研究成功建立了能够有效检测PKV血清特异性抗体的间接ELISA方法,且方法具有重复性好、敏感性高、特异性强、稳定性好等特点,对今后PKV的临床诊断及抗体检测试剂盒的开发奠定了重要基础。

关键词：猪嵴病毒 vp0 vp1 原核表达间接ELISA

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塞内卡病毒vp0蛋白豆蔻酰化修饰对病毒复制水平的影响

塞内卡病毒VP0蛋白豆蔻酰化修饰对病毒复制水平的影响

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作者：肖培宇中国农业科学院

学位级别：硕士

塞内卡病毒(Senecavirus,SVA)是小RNA病毒科(Picornaviridae)塞内卡病毒属(Senecavirus genus)的唯一成员,SVA感染可以导致猪水疱病。自2015年在我国首次报道SVA感染病例后,SVA陆续传播至我国各个省份和自治区。迄今为止,我国大多数省... 详细信息

塞内卡病毒(Senecavirus,SVA)是小RNA病毒科(Picornaviridae)塞内卡病毒属(Senecavirus genus)的唯一成员,SVA感染可以导致猪水疱病。自2015年在我国首次报道SVA感染病例后,SVA陆续传播至我国各个省份和自治区。迄今为止,我国大多数省份和地区均有SVA感染病例的报道,这对我国猪养殖业的健康发展造成了威胁。目前已证明小RNA病毒科中多种病毒的vp0蛋白发生了豆蔻酰化修饰,例如脊髓灰质炎病毒(Poliovirus,PV)、口蹄疫病病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)和柯萨奇病毒(Coxsackievirus B3,CVB3)。抑制vp0蛋白的豆蔻酰化修饰会影响这些病毒的复制。抑制Gag蛋白的豆蔻酰化修饰会影响HIV-1(Human immunodeficiency virus 1,HIV-1)病毒粒子的组装。然而,SVA的vp0蛋白是否发生豆蔻酰化修饰尚不清楚。为了研究SVA vp0蛋白是否发生豆蔻酰化,本研究使用了两种豆蔻酰基转移酶抑制剂(DDD885646和IMP-1088)处理BHK-21细胞,其作用是抑制细胞内的豆蔻酰基转移酶(Myristoyltranferases,NMTs)的生物学活性。用SVA-e GFP感染抑制剂处理后的细胞,分别在病毒感染后的第12 h和24 h观察细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。结果显示,NMTs抑制剂处理细胞中绿色荧光蛋白的表达量显著低于对照组细胞(DMSO处理)中荧光蛋白表达量,且荧光蛋白表达水平与抑制剂剂量呈负相关的关系。这一结果表明,抑制剂对SVA的抑制效应呈现明显的剂量依赖性。随后,我们将SVA vp0蛋白的氨基酸序列与豆蔻酰基转移酶底物共有序列对比后,发现其氨基酸序列与NMTs底物共有序列相符,因此我们推测SVA vp0蛋白可以发生豆蔻酰化修饰。为了证明SVA vp0蛋白可以发生豆蔻酰化修饰,我们构建了vp0蛋白真核表达质粒p CI-vp0-WT-e GFP以及豆蔻酰化修饰位点氨基酸突变的真核表达质粒p CI-vp0-G1A-e GFP。将其转染至细胞后,在共聚焦显微镜下观察到转染野生型质粒细胞中绿色荧光蛋白聚集分布在细胞质内,而转染突变质粒的细胞显示绿色荧光蛋白弥散分布在整个细胞中。此外,用IMP-1088(NMTs抑制剂)处理细胞后再转染野生型vp0质粒,结果发现绿色荧光蛋白既有在细胞质中聚集分布,也有部分细胞弥散均匀分布在细胞核中。豆蔻酰化发生在肽链N末端的甘氨酸(Gly)上,而豆蔻酰基具有亲脂性,将豆蔻酰化修饰位点突变后,vp0蛋白的细胞定位发生了改变。随后,我们研究豆蔻酰化的vp0在SVA复制中的作用。通过构建NMT1敲除细胞系,并测定SVA在NMT1敲除细胞系,NMT1瞬时过表达细胞以及正常细胞中的生长曲线。结果发现,SVA在NMT1敲除细胞系中的复制受到了明显的抑制作用,而在NMT1瞬时过表达的细胞中SVA的复制速度加快,但SVA最高复制滴度却未发生明显改变。在SVA感染性克隆中将豆蔻酰化修饰位点突变后,发现该突变为致死性突变。然而,将vp0豆蔻酸修饰基序GXXXS/TXX中第5位的苏氨酸(Thr)突变后,仍可以成功拯救出病毒,该病毒复制能力略弱于亲本病毒。本研究证明了SVA的vp0蛋白发生了豆蔻酰化修饰,且豆蔻酰基与vp0蛋白的亚细胞定位密切相关。阻止vp0的豆蔻酰化修饰会对SVA的复制产生明显的抑制效应,促进vp0的豆蔻酰化修饰会加快病毒的复制速度,但不会使病毒的最大复制滴度增加。vp0豆蔻酰化位点突变是一种致死性突变,但改变第五位关键氨基酸只是使病毒复制能力下降。

关键词：塞内卡病毒豆蔻酰化病毒复制豆蔻酰基转移酶 vp0

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PCBP2促进口蹄疫病毒增殖的机制研究

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畜牧兽医学报 2018年第7期49卷 1451-1459页

作者：何艳春杨文萍付绍祖郑海学杨孝朴甘肃农业大学动物医学院兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原微生物学口蹄疫流行病学国家重点实验室兰州730046

多聚胞嘧啶结合蛋白2(PCBP2)是一个能特异性结合RNA和DNA Poly(C)片段的蛋白,具有维持mRNA稳定和调节翻译的功能;同时,PCBP2能负调控VISA介导的信号转导通路,抑制Ⅰ型干扰素(IFNs)的产生。前期研究表明,PCBP2能调节口蹄疫病毒(foot-and-... 详细信息

多聚胞嘧啶结合蛋白2(PCBP2)是一个能特异性结合RNA和DNA Poly(C)片段的蛋白,具有维持mRNA稳定和调节翻译的功能;同时,PCBP2能负调控VISA介导的信号转导通路,抑制Ⅰ型干扰素(IFNs)的产生。前期研究表明,PCBP2能调节口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)的增殖,但具体机制不清楚。作者对此进行了研究,发现:1)免疫共沉淀和GST pull-down试验证实,PCBP2能与FMDV结构蛋白vp0、vp2、2B、2C和3D相互作用;2)进一步用双荧光素酶报告系统试验证明,PCBP2负调控VISA介导的信号通路,并且2C、3D、vp0和2B促进PCBP2的负调控作用;3)通过Western blot试验表明,FMDV vp0蛋白能促进PCBP2对VISA的特异性降解。总之,PCBP2与FMDV vp0相互作用,促进PCBP2降解天然免疫接头蛋白VISA,抑制IFN-β的产生,从而有利于FMDV在细胞中的繁殖和生长。

关键词：口蹄疫病毒天然免疫多聚胞嘧啶结合蛋白2 VISA vp0

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