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GLA缺乏对血管内皮ve-cadherin表达的作用机制研究

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GLA缺乏对血管内皮VE-cadherin表达的作用机制研究

作者：黄弘山东大学

学位级别：硕士

研究背景:法布里病是一种X连锁遗传性疾病,由α-半乳糖苷酶A(alpha-Galactosidase A,GLA)基因突变引起,导致该溶酶体酶缺乏。酶活性不足会引起底物鞘糖脂(主要是球状神经酰胺)在组织和体液中广泛蓄积,导致进行性多器官功能障碍。血管内... 详细信息

研究背景:法布里病是一种X连锁遗传性疾病,由α-半乳糖苷酶A(alpha-Galactosidase A,GLA)基因突变引起,导致该溶酶体酶缺乏。酶活性不足会引起底物鞘糖脂(主要是球状神经酰胺)在组织和体液中广泛蓄积,导致进行性多器官功能障碍。血管内皮细胞是底物球状神经酰胺蓄积的主要细胞类型之一。法布里病患者的血管并发症包括中风、心血管疾病和肾功能衰竭,这是造成患者死亡的主要原因。GLA缺失或底物球状神经酰胺的刺激可以引起多种内皮源性分子的表达和分泌发生变化,导致血管促炎状态、高凝反应和舒张功能障碍。血管内皮细胞作为血液和间质组织之间的半渗透屏障,在血管通透性和血管稳态维持中发挥重要作用。内皮屏障功能受损时会导致血管的高通透性,从而促进炎症反应和疾病的发生和发展。然而,关于法布里病内皮屏障功能目前知之甚少。ve-cadherin是主要的黏附连接蛋白,粘附连接的破坏会导致血管屏障功能障碍,从而导致血管内皮通透性增加。在本研究中,通过构建GLA基因敲减的内皮细胞模型,探究GLA缺乏对血管内皮细胞ve-cadherin表达的作用机制。研究目的:探究GLA敲减对血管内皮通透性的影响;明确GLA基因敲减时血管内皮细胞中粘附连接蛋白ve-cadherin表达变化及其调控机制。研究方法:1.探究GLA基因敲减对内皮细胞通透性的影响为了探究GLA基因敲减对内皮细胞通透性的影响,用GLA siRNA转染HUveCs 24h后,将细胞接种在24孔Transwell小室中。待细胞长成单层内皮细胞后,加入FITC-dextran评估在1、2、3、4h四个时间点的内皮细胞通透性。2.探究GLA基因敲减对血管内皮粘附连接蛋白ve-cadherin表达的作用提取GLA siRNA转染HUveCs 48 h后的RNA和蛋白质进行qRT-PCR和Western blot,检测ve-cadherin的表达水平。通过细胞免疫荧光染色检测内皮细胞间ve-cadherin的表达水平。3.探究GLA基因敲减对血管内皮转录因子ERG表达的作用GLA siRNA转染HUveCs 48 h,收集细胞RNA和蛋白质,通过qRT-PCR和Western blot实验检测转录因子ERG的表达水平。通过细胞免疫荧光染色检测内皮细胞中ERG的表达水平。4.验证转录因子ERG对ve-cadherin表达的调控作用构建ERG过表达质粒和ERG siRNA,分别将其转染至HUveCs48h,上调和敲减ERG的表达水平后,利用qRT-PCR和Western blot技术检测ERG和ve-cadherin的表达水平。5.验证转录因子ERG在GLA敲减的内皮细胞中对ve-cadherin表达的作用为了进一步验证转录因子ERG在GLA敲减的内皮细胞中对ve-cadherin表达的作用,本实验在转染ERG质粒的HUveCs中继续转染GLA siRNA,利用Western blot实验检测ERG和ve-cadherin的蛋白质表达水平。收集GLA si-RNA转染后的HUveCs进行蛋白质-DNA交联,通过细胞裂解和超声破碎,获得适当长度的染色质片段,采用染色质免疫共沉淀实验(ChIP)检测转录因子ERG与ve-cadherin启动子上-134/-118ETS位点的结合及其变化。研究结果:1.将转染GLA siRNA24h后的HUveCs接种在24孔transwell小室中,加入FITC-dextran后检测下室培养液的荧光强度,结果显示在1、2、3、4 h HUveCs的通透性与对照组相比增高。2.GLA siRNA转染至HUveCs 48 h,与对照组相比,ve-cadherin的mRNA和蛋白质水平均降低。免疫荧光显示ve-cadherin染色强度降低。3.GLA siRNA转染至HUveCs 48 h,与对照组相比,ERG的mRNA和蛋白质水平均降低。免疫荧光显示ERG染色强度降低。4.ERG过表达质粒转染至HUveCs48h后,与对照组相比,ve-cadherin的mRNA和蛋白质水平均升高。反之,ERG siRNA转染至HUveCs48h后,与对照组相比,ve-cadherin的mRNA和蛋白质水平均降低。5.ERG过表达质粒转染HUveCs 36 h后,将GLA siRNA转染至HUveCs 36 h,结果显示,ERG过表达使GLA基因敲减对ve-cadherin的下调作用消失。ChIP结果显示,ERG可与ve-cadherin启动子上-134/-118ETS位点结合。GLA基因敲减后,ERG与ve-cadherin启动子上-134/-118ETS位点的结合明显减少。研究结论:1.GLA敲减增加血管内皮细胞通透性。2.GLA敲减抑制ve-cadherin在血管内皮细胞中的表达水平。3.GLA敲减在血管内皮细胞中降低转录因子ERG的表达水平。4.转录因子ERG在血管内皮细胞中正向调控

关键词： GLA 内皮细胞通透性 ve-cadherin 转录因子ERG HUveC

Ruscogenin alleviates LPS-triggered pulmonary endothelial barrier dysfunction through targeting NMMHC IIA to modulate TLR4signaling

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Acta Pharmaceutica Sinica B 2022年第3期12卷 1198-1212页

作者： Yunhao Wu Xiu Yu Yuwei Wang Yalin Huang Jiahui Tang Shuaishuai Gong Siyu Jiang Yuanli Xia Fang Li Boyang Yu Yuanyuan Zhang Junping Kou State Key Laboratory of Natural Medicines Jiangsu Key Laboratory of TCM Evaluation and Translational ResearchDepartment of Pharmacology of Chinese Material MedicaSchool of Traditional Chinese PharmacyChina Pharmaceutical UniversityNanjing 211198China

Pulmonary endothelial barrier dysfunction is a hallmark of clinical pulmonary edema and contributes to the development of acute lung injury(ALI).Here we reported that ruscogenin(RUS),an effective steroidal sapogenin of Radix Ophiopogon japonicus,attenuated lipopolysaccharides(LPS)-induced pulmonary endothelial barrier disruption through mediating non-muscle myosin heavy chain IIA(NMMHC IIA)-Toll-like receptor 4(TLR4)interactions.By in vivo and in vitro experiments,we observed that RUS administration significantly ameliorated LPS-triggered pulmonary endothelial barrier dysfunction and ALI.Moreover,we identified that RUS directly targeted NMMHC IIA on its N-terminal and head domain by serial affinity chromatography,molecular docking,biolayer interferometry,and microscale thermophoresis analyses.Downregulation of endothelial NMMHC IIA expression in vivo and in vitro abolished the protective effect of RUS.It was also observed that NMMHC IIA was dissociated from TLR4 and then activating TLR4 downstream Src/vascular endothelial cadherin(ve-cadherin)signaling in pulmonary vascular endothelial cells after LPS treatment,which could be restored by RUS.Collectively,these findings provide pharmacological evidence showing that RUS attenuates LPS-induced pulmonary endothelial barrier dysfunction by inhibiting TLR4/Src/ve-cadherin pathway through targeting NMMHC IIA and mediating NMMHC IIA-TLR4 interactions.

关键词： Ruscogenin Acute lung injury Lipopolysaccharide Endothelial barrier Non-muscle myosin heavy chain IIA TLR4 ve-cadherin Interaction

血清ANGPTL4、ve-cadherin水平与急性脑梗死患者颈动脉易损斑块的关系

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中南医学科学杂志 2022年第5期50卷 762-764页

作者：黄颖胡存昆徐州市中心医院神经内科江苏省徐州市221000

目的分析血清人血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)、血管内皮细胞钙黏连蛋白(ve-cadherin)水平与急性脑梗死患者颈动脉斑块的关系。方法选取120例急性脑梗死患者作为观察组,另选择120例行体检的健康志愿者作为对照组,比较两组以及不同斑块... 详细信息

目的分析血清人血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)、血管内皮细胞钙黏连蛋白(ve-cadherin)水平与急性脑梗死患者颈动脉斑块的关系。方法选取120例急性脑梗死患者作为观察组,另选择120例行体检的健康志愿者作为对照组,比较两组以及不同斑块稳定性患者的ANGPTL4、ve-cadherin水平,分析血清ANGPTL4、ve-cadherin水平与急性脑梗死患者颈动脉易损斑块的关系。结果观察组的ANGPTL4水平低于对照组,ve-cadherin水平高于对照组(Pve-cadherin水平高于斑块稳定组(Pve-cadherin与内膜厚度以及斑块面积呈正相关(Pve-cadherin水平与急性脑梗死患者颈动脉易损斑块呈显著相关,可作为临床治疗的重要靶点。

关键词：颈动脉斑块急性脑梗死 ANGPTL4 ve-cadherin

哇巴因抑制钠泵β1亚单位和ve-cadherin减弱血管内皮细胞连接功能

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中国药理学通报 2008年第8期24卷 1093-1098页

作者：徐瑞成王娜徐忠伟陈雪芬呼文亮中国人民武装警察部队医学院.天津市职业和环境危害生物标志物重点实验室天津300162

目的探讨钠泵抑制剂哇巴因对血管内皮细胞连接的影响及机制。方法以人脐静脉内皮细胞(HUveCs)为靶细胞,Hoechst33342/PI双荧光染色法观察哇巴因作用后细胞凋亡或坏死特征,透射电镜和光镜观察细胞形态结构变化。应用半定量聚合酶链反应... 详细信息

目的探讨钠泵抑制剂哇巴因对血管内皮细胞连接的影响及机制。方法以人脐静脉内皮细胞(HUveCs)为靶细胞,Hoechst33342/PI双荧光染色法观察哇巴因作用后细胞凋亡或坏死特征,透射电镜和光镜观察细胞形态结构变化。应用半定量聚合酶链反应检测钠泵α1亚单位、β1亚单位、ve-cadherin和SnailmRNA的表达。结果0.1μmol.L-1哇巴因作用HUveCs24～48h,细胞死亡以凋亡为主,10μmol·L-1哇巴因作用24h,引起细胞坏死;对照组细胞间的细胞连接数量多,结构清晰,而经哇巴因作用后,细胞连接丧失,细胞脱落。哇巴因作用HUveCs后,钠泵α1亚单位和Snail表达上调,β1亚单位和ve-cadherin表达下降,其改变均呈剂量和时间依赖性。结论哇巴因通过下调血管内皮细胞钠泵β1亚单位和ve-cadherin的表达使细胞连接功能减弱。

关键词：哇巴因血管内皮细胞细胞连接钠泵 ve-cadherin Snail

小动脉硬化脑血管病危险因素分析及sTM、CD62P、ve-cadherin对其预后的预测

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中南医学科学杂志 2023年第1期51卷 83-86页

作者：李剑侠林小祥余勇波黄先锋东南大学附属中大医院江北院区南京市大厂医院神经外科江苏南京210048

目的分析小动脉硬化脑血管病的危险因素,及可溶性血栓调节蛋白(sTM)、P选择素(CD62P)、钙黏蛋白(ve-cadherin)对其预后的预测价值。方法选择小动脉硬化脑血管病患者180例为观察组,根据预后分为预后不良组和预后良好组,另设50例健康者... 详细信息

目的分析小动脉硬化脑血管病的危险因素,及可溶性血栓调节蛋白(sTM)、P选择素(CD62P)、钙黏蛋白(ve-cadherin)对其预后的预测价值。方法选择小动脉硬化脑血管病患者180例为观察组,根据预后分为预后不良组和预后良好组,另设50例健康者为对照组。检测各组血清sTM、ve-cadherin、CD62P血小板水平,分析其与预后的相关性,以及三者联合检测对预后的评估价值,分析小动脉硬化脑血管病的危险因素。结果 sTM、ve-cadherin、CD62P血小板水平观察组高于对照组,预后不良组高于预后良好组(Pve-cadherin、CD62P血小板水平与预后呈正相关(Pve-cadherin、CD62P血小板水平是小动脉硬化脑血管病的危险因素(Pve-cadherin、CD62P是小动脉硬化脑血管病的危险因素,三者联合应用对其预后的预测价值较高。

关键词： sTM CD62P ve-cadherin 小动脉硬化脑血管病危险因素预后

The P2Y<sub>2</sub>Receptor Interacts with ve-cadherin and veGF Receptor-2 to Regulate Rac1 Activity in Endothelial Cells

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Journal of Biomedical Science and Engineering 2014年第14期7卷 1105-1121页

作者： Zhongji Liao Chen Cao Jianjie Wang Virginia H. Huxley Olga Baker Gary A. Weisman Laurie Erb Department of Medicine University of California San Diego USA Department of Biochemistry Life Sciences Center University of Missouri Columbia USA Department of Biomedical Sciences Missouri State University Springfield USA Department of Medical Pharmacology and Physiology University of Missouri Columbia USA School of Dentistry University of Utah Salt Lake City USA

Vascular endothelial cadherin (ve-cadherin) mediates homophylic adhesion between endothelial cells and is an important regulator of angiogenesis, blood vessel permeability and leukocyte trafficking. Rac1, a member of the Rho family of GTPases, controls ve-cadherin adhesion by acting downstream of several growth factors, including angiopoietin-1 and vascular endothelial growth factor (veGF). Here we show that UTP-induced activation of the Gq protein-coupled P2Y2 nucleotide receptor (P2Y2R) in human coronary artery endothelial cells (HCAECs) activated Rac1 and caused a transient complex to form between P2Y2R, ve-cadherin and veGF receptor-2 (veGFR-2). Knockdown of ve-cadherin expression with siRNA did not affect UTP-induced activation of extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK1/2) but led to a loss of UTP-induced Rac1 activation and tyrosine phosphorylation of p120 catenin, a cytoplasmic protein known to interact with ve- cadherin. Activation of the P2Y2R by UTP also caused a prolonged interaction between p120 catenin and vav2 (a guanine nucleotide exchange factor for Rac) that correlated with the kinetics of UTP-induced tyrosine phosphorylation of p120 catenin and ve-cadherin. Inhibitors of veGFR-2 (SU1498) or Src (PP2) significantly diminished UTP-induced Rac1 activation, tyrosine phosphorylation of p120 catenin and ve-cadherin, and association of the P2Y2R with ve-cadherin and p120 catenin with vav2. These findings suggest that the P2Y2R uses Src and veGFR-2 to mediate association of the P2Y2R with ve-cadherin complexes in endothelial adherens junctions to activate Rac1.

关键词： ve-cadherin P2Y Receptors Rac Endothelium Adherens Junctions

ve-cadherin在不同侵袭性能非小细胞肺癌细胞株的表达及沉默ve-cadherin对非小细胞肺癌细胞株侵袭、迁移的影响

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重庆医科大学学报 2014年第1期39卷 13-17页

作者：顾雪霜陶韬陈虹周俊豪彭单伊张丽君重庆医科大学附属第一医院呼吸与危重症学科重庆400016

目的:探讨ve-cadherin在不同侵袭性能非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞株的表达及沉默vecadherin对NSCLC细胞株侵袭、迁移的影响。方法:通过定量PCR及Western blot检测ve-cadherin在高侵袭性能的NSCLC细胞株PG、中度侵袭性能的NSCLC细胞株H1299及低侵袭性能的NSCLC细胞株PA中mRNA及蛋白的表达;并通过RNA干扰沉默ve-cadherin的表达来探讨其对NSCLC细胞株PG侵袭、迁移能力的影响。结果:ve-cadherin在3种NSCLC细胞株中都有表达,且其mRNA及蛋白在3种细胞株中的表达强度依次为PG、H1299、PA,PG与H1299相比较,差异有统计学意义(P=0.000),PA与PG、H1299相比较,差异均具有统计学意义(P=0.000);Transwell小室基质侵袭实验结果显示,干扰组与对照组的侵袭细胞数分别为(34.33±3.06)个和(86.00±7.93)个,组间比较差异有统计学意义(P=0.000);划痕损伤实验结果显示,对照组与干扰转染组的细胞迁移距离相比,24 h内没有明显差异(P=0.825),而48、72 h内对照组明显高于干扰转染组,差异具有统计学意义(P=0.000)。结论:ve-cadherin可能参与NSCLC的侵袭和迁移,并在此过程中起重要作用;ve-cadherin可能会成为治疗NSCLC侵袭、血管生成和转移的又一新靶点。

关键词：非小细胞肺癌 ve-cadherin 侵袭转移

血清MCP-1、ve-cadherin和S-100蛋白水平变化对脑梗死患者病情的影响

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基因组学与应用生物学 2020年第1期39卷 303-307页

作者：元顺女朴美花金丹延边大学附属医院检验科延吉133000 延吉市医院神经内科延吉133000

探讨血清MCP-1、ve-cadherin和S-100蛋白水平变化对脑梗死患者病情的影响。选择2016年3月至2017年5月期间我院确诊的脑梗死患者60例作为研究对象,男性30例,女性30例,平均年龄为(60.2±8.1)岁。选择同期在我院进行体检的30名健康志愿者... 详细信息

探讨血清MCP-1、ve-cadherin和S-100蛋白水平变化对脑梗死患者病情的影响。选择2016年3月至2017年5月期间我院确诊的脑梗死患者60例作为研究对象,男性30例,女性30例,平均年龄为(60.2±8.1)岁。选择同期在我院进行体检的30名健康志愿者作为对照组。采用酶联免疫双抗体夹心法检测受试者血清MCP-1、ve-cadherin和S-100蛋白水平。脑梗死患者的血清MCP-1、ve-cadherin和S-100水平均高于对照组(pve-cadherin和S-100水平显著升高(pve-cadherin和S-100水平显著低于中型和重型患者(pve-cadherin和S-100水平均显著低于重型患者(pve-cadherin和S-100参与脑梗死的发生发展,并且与脑梗死患者的临床表现和神经功能缺损程度有关。

关键词：脑梗死 MCP-1 ve-cadherin S-100 神经功能缺损程度

持续小剂量化疗对A549肺癌生长及ve-cadherin的影响

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肿瘤防治研究 2011年第6期38卷 624-627页

作者：张明川梅同华厉明李长毅盛伟利李胜谢华重庆市铜梁县人民医院呼吸科重庆402560 南昌大学附属第一医院呼吸科重庆医科大学附属第二医院呼吸科四川省肿瘤医院

目的检测不同剂量环磷酰胺化疗后,荷A549肺腺癌裸鼠皮下肿瘤生长情况及肿瘤组织中ve-cadherin的表达。方法右季肋部皮下注射A549细胞悬液,建立荷A549肺腺癌裸鼠模型,分为三组,分别给予持续小剂量(Low-Dose Metronomic,LDM)CTX(环磷酰胺... 详细信息

目的检测不同剂量环磷酰胺化疗后,荷A549肺腺癌裸鼠皮下肿瘤生长情况及肿瘤组织中ve-cadherin的表达。方法右季肋部皮下注射A549细胞悬液,建立荷A549肺腺癌裸鼠模型,分为三组,分别给予持续小剂量(Low-Dose Metronomic,LDM)CTX(环磷酰胺)、最大耐受剂量(MaximumTolerable Dose,MTD)CTX和0.9%氯化钠溶液化疗,每周测量肿瘤体积,21天治疗结束取皮下肿瘤组织,以免疫组织化学SP法检测三组裸鼠皮下肿瘤组织中ve-cadherin的表达,以RT-PCR法检测癌组织中ve-cadherin基因含量。结果持续小剂量组肿瘤生长明显慢于大剂量组和对照组,ve-cadherin表达及基因含量显著低于大剂量组和对照组(Pve-cadherin表达下调,抑制肿瘤血管生成,从而持续抑制肿瘤生长。

关键词：化疗小剂量肺癌 ve-cadherin 逆转录聚合酶链反应