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神经解剖学杂志 2018年第4期34卷 467-472页

作者：高健王德秀王凤斌王玉良潍坊医学院生理学教研室潍坊261053 潍坊医学院机能学实验室潍坊261053 潍坊医学院认知神经科学实验室潍坊261053

目的:在血管性痴呆(vascular dementia,vd)模型大鼠,观察自噬相关蛋白LC3和Beclin-1在海马CA1区神经元中的表达变化情况。方法:采用重复夹闭双侧颈总动脉(CCA)同时腹腔注射硝普钠溶液方法制备vd大鼠模型,在1、3、5和7 d四个时间点,分别... 详细信息

目的:在血管性痴呆(vascular dementia,vd)模型大鼠,观察自噬相关蛋白LC3和Beclin-1在海马CA1区神经元中的表达变化情况。方法:采用重复夹闭双侧颈总动脉(CCA)同时腹腔注射硝普钠溶液方法制备vd大鼠模型,在1、3、5和7 d四个时间点,分别采用Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力;HE染色观察CA1区神经元形态变化情况;免疫组化和Western Blot观察海马CA1区神经元上LC3和Beclin-1的表达情况。结果:模型组大鼠各时间点的逃逸潜伏期(escape latency,EL)比假手术组均明显延长(P模型组大鼠海马神经元出现严重损伤,且随时间延长逐渐加重。免疫组化和Western Blot积分光密度值测定结果显示,模型组大鼠各时间点LC3和Beclin-1的表达均比假手术组明显升高(Pvd模型大鼠缺血再灌注短时间内海马CA1区神经元出现严重损伤,伴有自噬相关的LC3和Beclin-1一过性表达升高。

关键词： vd模型自噬 LC3 Beclin-1 海马

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下调PTEN对血管性痴呆大鼠学习记忆的影响及其机制的研究

下调PTEN对血管性痴呆大鼠学习记忆的影响及其机制的研究

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作者：韦永琼重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:血管性痴呆(Vascular dementia,vd)是由脑血管疾病引起的脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合症,以记忆、认知功能缺损为主,所以有效改善患者的学习记忆功能是血管性痴呆研究的重点和突破点所在。第10号染色体同源丢失性磷酸酶... 详细信息

目的:血管性痴呆(Vascular dementia,vd)是由脑血管疾病引起的脑功能障碍而产生的获得性智能损害综合症,以记忆、认知功能缺损为主,所以有效改善患者的学习记忆功能是血管性痴呆研究的重点和突破点所在。第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)是具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因,研究发现下调PTEN表达对神经元有保护作用,且作为PI3K/Akt信号通路的关键负性调节因子,PTEN在神经元分化、树突分枝及突触可塑性方面也可发挥重要作用。因此,预测将其下调有可能参与改善vd大鼠的学习记忆能力。本课题利用PTEN特异性RNAi(RNA interference,RNA干扰)的重组腺病毒载体,转染血管性痴呆大鼠模型,选择与学习记忆相关的转录因子环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein,CREB)为切入点,观察PTEN基因沉默对痴呆海马区的病理改变、CREB表达变化以及学习记忆能力的改善,阐明PTEN在血管性痴呆突触可塑性及学习记忆中的重要作用,以期为临床血管性痴呆的基因治疗奠定基础。方法:1.应用人胚肾293细胞扩增PTEN特异性RNAi的重组腺病毒AdR-siPTEN,采用赛多利斯腺病毒纯化试剂盒纯化病毒并测定其滴度;2.分别用适当剂量的重组腺病毒和空病毒(阴性对照)转染缺血痴呆大鼠海马组织,荧光显微镜观察红色荧光蛋白的表达,RT-PCR及Western blotting检测腺病毒转染后PTEN基因表达下降情况,探明RNAi对PTEN的抑制效率;3. 40只SD大鼠随机分为缺血痴呆组(vd组),假手术组和腺病毒处理组(siPTEN组),阴性对照组(AdRFP组)。4周后分别应用水迷宫、HE和Nissl染色检测各组大鼠行为学及组织病理形态学变化,观察下调PTEN对痴呆大鼠学习记忆功能的影响;4.应用RT-PCR及免疫组化分别从mRNA和蛋白水平检测PTEN表达下调后海马区Akt、CREB表达的变化,探讨下调PTEN对血管性痴呆大鼠海马神经元CREB表达的影响,从而探讨PTEN基因改善缺血痴呆大鼠学习记忆功能的分子机制。结果:1.重组腺病毒转染293细胞后,荧光显微镜下可观察到明确的红色荧光,扩增并纯化后AdR-siPTEN的滴度为:3.36×1010 pfu/ml;AdRFP的滴度为:2.98×1010pfu/ml。2.转染腺病毒一定时限后,大鼠海马组织均出现红色荧光蛋白阳性表达;RT-PCR和Western blot结果显示:与假手术组相比,缺血痴呆后,PTEN mRNA和蛋白水平明显增高(p0.05);3.水迷宫检测发现缺血痴呆后大鼠逃避潜伏期明显延长,跨越平台次数显著减少,经siPTEN处理后延长的逃避潜伏期缩短,减少的跨越平台次数增多(Pvd和AdRFP组大鼠;HE染色后光镜下观察,siPTEN组海马变性程度较vd和AdRFP组明显减轻,其结果与Nissl染色结果相吻合;4. RT-PCR及免疫组化分别检测CREB mRNA基因表达和蛋白水平结果均显示:siPTEN组海马部位CREB水平较AdRFP组明显升高,但未至正常水平(p﹤0.01),表明siPTEN组大鼠空间学习记忆障碍得到改善可能与海马区CREB表达升高有关。结论:1.采用293细胞成功扩增了大量重组腺病毒AdR-siPTEN以满足后续实验的需要。2.腺病毒能高效感染海马组织,有效进行PTEN特异性siRNA基因转导;腺病毒介导RNAi可有效、稳定地抑制海马组织中PTEN的表达。3.缺血性痴呆后,大鼠出现空间学习记忆障碍,腺病毒介导RNAi沉默PTEN基因可明显减轻缺血痴呆海马神经元损伤及海马变性,提高CREB表达水平,从而明显改善vd大鼠的学习记忆能力。

关键词： PTEN vd模型腺病毒 CREB RNAi

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