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敲除usp13促进棕榈酸诱导的小鼠肝实质细胞凋亡

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中国生物工程杂志 2022年第4期42卷 9-16页

作者：王婷刘凯李柯颖陈旭任广明杨晓明安徽医科大学基础医学院合肥230032 军事科学院军事医学研究院生命组学研究所北京100850 青岛大学青岛266071

目的:研究去泛素化酶usp13对棕榈酸诱导的肝实质细胞凋亡的影响,并对其机制进行初步探究。方法:两步胶原酶灌注法分离小鼠原代肝实质细胞并采用棕榈酸处理;甘油三酯酶法及油红O染色检测肝实质细胞中脂质的累积;MTS和LDH试剂盒检测细胞活... 详细信息

目的:研究去泛素化酶usp13对棕榈酸诱导的肝实质细胞凋亡的影响,并对其机制进行初步探究。方法:两步胶原酶灌注法分离小鼠原代肝实质细胞并采用棕榈酸处理;甘油三酯酶法及油红O染色检测肝实质细胞中脂质的累积;MTS和LDH试剂盒检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;qPCR检测凋亡相关基因的表达以及免疫印迹法检测Caspase-3的活化。结果:敲除usp13基因并不影响棕榈酸诱导下肝实质细胞的甘油三酯累积,但导致细胞损伤加重,凋亡增加。机制研究显示,敲除usp13促使肝实质细胞中抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xl表达下调,促凋亡基因Bid、p53表达上调,以及Caspase-3活化增强。结论:初步揭示了usp13调控棕榈酸诱导下肝实质细胞凋亡的机制,为深入研究usp13调控非酒精性脂肪性肝炎的发生、发展奠定了基础。

关键词：非酒精性脂肪性肝炎 usp13 细胞凋亡棕榈酸小鼠原代肝实质细胞

敲低去泛素化酶usp13抑制K562细胞的增殖

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中国生物工程杂志 2021年第5期41卷 1-7页

作者：陶守松任广明尹荣华杨晓明马文兵葛志强天津大学化工学院制药工程系天津300072 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院生命组学研究所北京100850 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院卫生勤务与血液研究所北京100850

目的:研究去泛素化酶usp13对人慢性髓系白血病细胞系K562增殖和凋亡的影响,并进行初步的机制探究。方法:构建p LKO. 1-shusp13-GFP慢病毒干涉载体,慢病毒包装后感染并建立稳定敲低usp13的K562细胞株。免疫印迹检测K562细胞中usp13蛋白... 详细信息

目的:研究去泛素化酶usp13对人慢性髓系白血病细胞系K562增殖和凋亡的影响,并进行初步的机制探究。方法:构建p LKO. 1-shusp13-GFP慢病毒干涉载体,慢病毒包装后感染并建立稳定敲低usp13的K562细胞株。免疫印迹检测K562细胞中usp13蛋白的敲低效率。流式细胞术分析敲低usp13对K562细胞增殖和凋亡的影响。免疫共沉淀和蛋白质泛素化实验探究usp13调控K562细胞的分子机制。结果:成功构建pLKO. 1-shusp13-GFP慢病毒干涉载体,同时利用慢病毒体系获得稳定敲低usp13的K562细胞株。流式细胞术结果显示,敲低usp13促进K562细胞凋亡、抑制细胞增殖。分子机制研究发现,敲低usp13通过增强c-Myc泛素化进而导致其蛋白质水平降低。结论:初步揭示了usp13调控K562细胞增殖和凋亡的分子机制,为治疗慢性髓系白血病提供了潜在的靶点。

关键词：人慢性髓系白血病 K562细胞 usp13 增殖和凋亡 c-Myc

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usp13敲除小鼠的制备与分析

USP13敲除小鼠的制备与分析

作者：荆颖颖武汉大学

学位级别：硕士

病毒感染导致的各种疾病对人类生命安全和社会生产造成极大威胁。根据病毒的遗传物质组成,病毒可分为RNA病毒和DNA病毒。其中,DNA病毒以及逆转录RNA病毒在感染与复制的过程中产生的双链DNA(dsDNA)是一类重要的病原相关分子模式(Pathogen... 详细信息

病毒感染导致的各种疾病对人类生命安全和社会生产造成极大威胁。根据病毒的遗传物质组成,病毒可分为RNA病毒和DNA病毒。其中,DNA病毒以及逆转录RNA病毒在感染与复制的过程中产生的双链DNA(dsDNA)是一类重要的病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),能被宿主编码的模式识别受体如cGAS,IFI16,DDX41等识别。这些模式识别受体或通过直接招募下游接头蛋白MITA(又叫做STING)或产生2’-3’cGAMP结合至MITA,导致MITA的寡聚化而活化。MITA随后招募下游蛋白激酶TBK1与转录因子IRF3,进而促进IRF3的磷酸化。研究表明,MITA的活性受到泛素化的严格调控,如RNF5催化MITA发生K48链接的泛素化以及蛋白酶体途径降解,而AMFR诱导MITA发生K27-链接的泛素化进而促进TBK1的招募。然而,对MITA的去泛素化调控则不是很清楚。我们筛选了与MITA相互作用的去泛素化酶,发现usp13与MITA有相互作用,初步研究结果表明,敲低usp13促进DNA病毒感染诱导I性干扰素的表达以及IRF3的活化,暗示usp13抑制宿主抗DNA病毒免疫应答。为了研究usp13在体内调控宿主抗病毒免疫反应的功能与机制,我们通过CRISPR/Cas9技术建立了 usp13敲除小鼠,并初步分析了敲除usp13对小鼠发育与免疫细胞分化的影响。结果表明小鼠usp13基因组的1号外显子有一个脱氧胞嘧啶碱基的插入,导致翻译提前终止。usp13缺陷小鼠的出生比例满足孟德尔遗传定律,小鼠的生长发育以及免疫器官内的免疫细胞组成等没有明显缺陷。进一步的研究结果表明,与野生型细胞相比,HSV-1感染后的usp13缺陷细胞中MITA与TBK1的相互作用显著增强,I型干扰素等细胞因子的表达量显著升高。这些结果表明usp13抑制宿主抗DNA病毒免疫反应信号转导。

关键词：天然免疫去泛素化酶 usp13 MITA DNA病毒

usp13通过去泛素化TIMELESS促进乳腺癌细胞增殖的分子机制

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USP13通过去泛素化TIMELESS促进乳腺癌细胞增殖的分子机制

作者：郭婉萍大连理工大学

学位级别：硕士

去泛素化酶(Deubiquitinating Enzymes,DUBs)是哺乳动物体内一类重要的翻译后修饰酶,近些年来研究发现,在多种癌症中,DUBs家族成员参与癌症相关蛋白的翻译后修饰,从而调控癌症的发生发展与预后。泛素特异性蛋白酶(Ubiquitin-specific pr... 详细信息

去泛素化酶(Deubiquitinating Enzymes,DUBs)是哺乳动物体内一类重要的翻译后修饰酶,近些年来研究发现,在多种癌症中,DUBs家族成员参与癌症相关蛋白的翻译后修饰,从而调控癌症的发生发展与预后。泛素特异性蛋白酶(Ubiquitin-specific protease13,usp)家族是DUBs中数量最庞大的一类,也是与乳腺癌关系最密切的一类去泛素化酶亚家族。usp家族成员usp13在近些年的研究报道中被发现在多种癌症组织中表达水平明显上调,是一个潜在的抗癌药物设计靶点。Timeless是生物体内重要的周期节律蛋白之一,在调节细胞周期,凋亡,代谢和DNA复制与修复中发挥重要的作用。过往研究发现,Timeless与多种癌症的发生发展关系密切,包括乳腺癌。但相关研究中对Timeless翻译后修饰极少涉及,本研究主要从Timeless的去泛素化修饰入手,研究usp13这一去泛素化酶对Timeless的作用及其分子机制,进而揭示其对乳腺癌细胞增殖的影响。本文主要研究工作及成果如下:(1)通过蛋白质免疫印迹实验研究usp13对乳腺癌相关蛋白水平的影响,发现usp13能够明显的上调Timeless的蛋白水平,且二者在多种细胞系中的内源表达存在正协同性;(2)免疫共沉淀和GST-Pulldown实验研究发现usp13与Timeless二者之间存在外源与内源的蛋白质直接相互作用。免疫荧光共定位实验发现二者共定位在细胞核内,进一步证明了二者之间互作的可能;(3)通过蛋白质免疫印迹实验检验Timeless的半衰期,当过表达usp13时能够明显延长Timeless的半衰期,反之,敲低usp13则明显缩短Timeless的半衰期。此外,当用MG132抑制蛋白酶体通路时,usp13无法提高Timeless的蛋白水平,进一步通过外源泛素化实验发现,usp13能够去泛素化Timeless,从而提高其稳定性;(4)通过MTT和克隆形成实验研究发现,过表达Timeless的同时敲低usp13,乳腺癌细胞的增殖明显下调,当回补usp13的表达时,细胞增殖也得到了明显的恢复。综上所述,usp13通过去泛素化Timeless提高其蛋白稳定性,从而进一步促进乳腺癌细胞的增殖。说明usp13可作为一个潜在的乳腺癌分子药物靶点,将为解决乳腺癌治疗难题提供新的思路。

关键词：去泛素化酶 usp13 Timeless 乳腺癌增殖

usp13抑制NDV诱导的肝癌细胞凋亡机制

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USP13抑制NDV诱导的肝癌细胞凋亡机制

作者：黄湘湖南大学

学位级别：硕士

新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)属于副粘液病毒科下的一种禽类病毒,它能够特异性感染并杀伤肿瘤细胞。经过临床实验的验证,NDV对于人体的危害是非常微弱的,通过自身的调节可以很快清除病毒,因此NDV可以被当作一种非常安全的... 详细信息

新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)属于副粘液病毒科下的一种禽类病毒,它能够特异性感染并杀伤肿瘤细胞。经过临床实验的验证,NDV对于人体的危害是非常微弱的,通过自身的调节可以很快清除病毒,因此NDV可以被当作一种非常安全的溶瘤病毒。NDV不仅能够直接诱导肿瘤细胞死亡,而且可以诱导人体免疫系统产生各种细胞因子或者影响肿瘤细胞的相关免疫原性来杀伤肿瘤细胞。由于现在癌症的传统治疗方法效果不佳,而溶瘤病毒具有特异性杀伤肿瘤细胞的特点,因此NDV用于癌症治疗成为目前一个非常火热的领域。肝癌被认为是世界上第六大频发的恶性肿瘤,同时该肿瘤具有恶性程度较高、病情发展很迅速、手术后恢复性较差等特点,所以肝癌患者呈现高死亡率。现在肝癌患者主要采用手术切除的传统方法治疗,同时兼具一些辅助手段,例如放射线治疗、化学药物治疗等,然而使用这些治疗方法得到的效果却不尽如人意,甚至还存在严重的副作用,所以急需研发新型的肝癌治疗方法。正在这时候溶瘤病毒治疗肿瘤开始出现在研究者的视野里,但是把NDV治疗肿瘤全面推广到临床应用中去还存在很大的困难,这也是当前有待解决的问题。本文主要探究了usp13抑制NDV诱导的肝癌细胞凋亡机制。首先用NDV分别感染两种不同类型的肝癌细胞Huh7和HLCZ01,我们发现usp13无论是mRNA和蛋白都呈现一个下调的趋势,这暗示了usp13在NDV诱导肝癌细胞凋亡中扮演者重要角色。然后分别构建usp13的过表达和沉默质粒,发现在两种肝癌细胞系中过表达usp13抑制NDV诱导的肝癌细胞凋亡,而敲低usp13的水平,促进NDV诱导的肝癌细胞凋亡。最后在机制的探讨过程中,发现usp13不影响细胞内NDV的复制,但是增强凋亡信号通路中的抑凋亡分子Bcl-2表达,从而抑制肝癌细胞的凋亡。基于此,我们认为usp13可能通过增强Bcl-2表达,抑制NDV诱导的肝癌细胞凋亡。本研究丰富了NDV对肿瘤细胞的溶瘤机理,而且为溶瘤病毒用于肝癌的治疗提供了新的理论基础。

关键词： usp13 NDV 肝癌细胞凋亡 c-PARP Bcl-2

usp13调控TNF诱导的细胞坏死机制的初步研究

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USP13调控TNF诱导的细胞坏死机制的初步研究

作者：史旭颖福建医科大学

学位级别：硕士

目的:构建去泛素化酶库并且筛选寻找调控TNF诱导细胞坏死信号通路的去泛素化酶。初步研究去泛素化酶对TNF诱导的细胞坏死作用,进一步阐明去泛素化酶对细胞坏死作用的机制。研究内容:在去泛素化酶库里对筛选出的调控TNF诱导细胞坏死信号... 详细信息

目的:构建去泛素化酶库并且筛选寻找调控TNF诱导细胞坏死信号通路的去泛素化酶。初步研究去泛素化酶对TNF诱导的细胞坏死作用,进一步阐明去泛素化酶对细胞坏死作用的机制。研究内容:在去泛素化酶库里对筛选出的调控TNF诱导细胞坏死信号通路的去泛素酶usp13的酶活性以及两个结构域对执行细胞坏死功能是否具有重要作用进行初步研究。方法:1.通过查找去泛素化酶库所包含的基因,设计这些基因特异的克隆引物,用高保真的DNA聚合酶扩增相应的基因,并将上述的片段连接到pbob-c-flag慢病毒载体中。2.将上述质粒按照慢病毒实验的包装方法,获得可以表达相应基因的慢病毒,病毒感染L929细胞,感染48小时后用TNF刺激感染有相应基因的细胞株,利用流式细胞仪分析细胞死亡的情况。通过数据分析,筛选出对TNF诱导细胞坏死有作用的去泛素化酶usp13。3.设计usp13酶活突变体以及结构域缺失体的基因特异的克隆引物,用高保真的DNA聚合酶扩增相应的片段,并将上述的片段连接到pbob-c-HA载体中,将这些质粒按慢病毒包装的方法包装慢病毒并感染L929细胞中,48h后加入TNF刺激,利用流式细胞仪分析TNF刺激下细胞死亡的情况。结果:1.根据已知去泛素化酶库基因序列,构建71个去泛素化酶基因。2.在L929中过表达去泛素化酶,利用流式细胞仪分析,筛选出usp13对TNF诱导的细胞坏死具有促进作用。3.构建usp13基因酶活突变体和相关结构域缺失体,利用流式细胞仪分析发现usp13-C345A突变同样能促进TNF诱导的细胞坏死,usp13的zf-UBP和UBA结构域不能促进对TNF诱导的细胞坏死。结论:1.过表达usp13可以促进TNF介导的细胞坏死信号通路。***13调控细胞坏死的功能是不依赖于其去泛素化酶的活性的。***13的zf-UBP和UBA结构域对于酶执行细胞坏死功能都很重要。

关键词：细胞坏死去泛素化酶 usp13 TNF

去泛素化酶usp13在非小细胞肺癌中的表达与功能探究

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去泛素化酶USP13在非小细胞肺癌中的表达与功能探究

作者：吴越大连医科大学

学位级别：硕士

随着发病率和死亡率的增加,癌症在中国成为主要致死原因。肺癌,作为死亡率第一,发病率第一的恶性癌症,被广泛研究,其主要分为非小细胞肺癌NSCLC(Non-Small Cell Lung Cancer)和小细胞肺癌SCLC(Small-Cell Lung Cancer)。NSCLC具有可手... 详细信息

随着发病率和死亡率的增加,癌症在中国成为主要致死原因。肺癌,作为死亡率第一,发病率第一的恶性癌症,被广泛研究,其主要分为非小细胞肺癌NSCLC(Non-Small Cell Lung Cancer)和小细胞肺癌SCLC(Small-Cell Lung Cancer)。NSCLC具有可手术切除困难,术后容易发生转移、复发,对放化疗不敏感等特点不容易进行传统治疗,深深困扰非小细胞肺癌患者。针对NSCLC靶向药物研究越来越热门,分子靶向治疗中,去泛素化酶对NSCLC进行治疗也逐渐被探索。去泛素化酶有5个家族,其中usp(ubiquitin specific proteases)家族数量和种类最为庞大。其中去泛素化酶usp13(ubiquitin specific proteases 13)作为一个热门的usp家族成员,2016到2018年在功能调控作用上被广泛研究,发表Natrue Communication 5篇。其主要作用包括增强抗感染的免疫能力,调节DNA损伤修复,卵巢癌扩增异常表达和代谢调节,内质网相关降解作用,调控癌蛋白泛素化等。目的:本课题从usp13在不同癌种间的异常扩增角度入手,分析usp13在正常组织与肿瘤中的mRNA表达,探究usp13在NSCLC中异常扩增的本质。通过美国癌症研究数据库(TCGA,The Cancer GenomeAtlas)大数据分析usp13基因在NSCLC中的扩增和表达的关系,筛选可能与usp13存在潜在关系的蛋白,在细胞水平和动物水平探究usp13在NSCLC中的促瘤机制。方法:通过TCGA美国癌症研究数据库,探寻usp13所在的3号染色体基因组相关CNV(copy number variation)的变化;运用从UCSC将illuminaHiseq测序数据经过log2(RSEM+1)转化成cgData储存的三级数据,来分析肿瘤中usp13的mRNA表达水平,以及usp13相关系数高的基因,从而探寻usp13在NSCLC中的功能。通过分子克隆的手段,给不同结构域的usp13带上GFP荧光标签,探究usp13结构域与定位的关系。通过稳转基因沉默技术(sh-RNA)将usp13敲低,探究usp13在NSCLC细胞中的作用。利用免疫缺陷小鼠,探究usp13在体内成瘤中的作用。结果:从usp13的mRNA表达来看,针对癌与癌旁的比较,发现usp13的mRNA表达量在肉瘤,前列腺癌和肠癌中,表达上调;在肺癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌、子宫癌、胆管癌、甲状腺癌和肾癌中下调,其中肾癌下调最为显著。从usp13基因扩增来看,肺鳞癌中usp13基因拷贝子变化(CNV,copy number variation)最大,出现位居第一的扩增。通过分析TCGA肺鳞癌的扩增,以及mRNA水平的表达,我们发现,肺鳞癌usp13显著扩增是由于3号染色q臂有一段显著扩增区域,同时扩增区域CNV与mRNA表达成正相关。从临床病人蛋白水平来看,usp13在癌中表达略高于癌旁。usp13定位于细胞核和细胞质。从功能来看,通过TCGA肺癌患者的测序数据,筛选与usp13相关性高的基因,筛选出与usp13有潜在关系的基因20个左右。通过GO分析,对这些基因进行功能和结构互作进行分析,发现usp13潜在的调控功能(肺腺癌可能和剪接相关,肺鳞癌可能和磷朊相关)。通过不同结构域的usp13细胞定位,我们发现去掉锌指结构域,usp13在细胞中成点状分布。在NSCLC细胞系中,利用基因沉默技术敲低usp13,发现usp13通过稳定磷酸化AKT促使细胞生长。抑制usp13的表达,裸鼠早期成瘤能力减弱。

关键词： NSCLC usp13 Hiseq 成瘤

miR-130b-3p靶向usp13对乳腺癌作用机制的研究

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miR-130b-3p靶向USP13对乳腺癌作用机制的研究

作者：白园山西医科大学

学位级别：硕士

目的:研究人乳腺癌细胞系MCF-7中usp13的表达水平及miR-130b-3p靶向usp13对乳腺癌细胞功能的影响。方法:用实时荧光定量PCR,检测人正常乳腺上皮细胞以及人乳腺癌细胞系（MCF-7）中usp13的表达水平。构建usp13过表达载体转染乳腺癌细胞系... 详细信息

目的:研究人乳腺癌细胞系MCF-7中usp13的表达水平及miR-130b-3p靶向usp13对乳腺癌细胞功能的影响。方法:用实时荧光定量PCR,检测人正常乳腺上皮细胞以及人乳腺癌细胞系（MCF-7）中usp13的表达水平。构建usp13过表达载体转染乳腺癌细胞系MCF-7,然后用迁移和侵袭实验检测迁移和侵袭能力的变化情况;生物信息学预测并构建miRNA mimic与其靶基因野生型及突变型共转染细胞系,进行双荧光素酶报告基因实验,检测细胞中荧光素酶活性,判断miRNA能否通过特异性结合位点靶向作用于其靶基因。结果:1.相对于正常乳腺上皮细胞,乳腺癌细胞MCF-7中,usp13的表达水平相对较低（P＜0.01）。***13过表达可显著抑制MCF-7细胞的迁移及侵袭能力。***13序列上有miR-130b-3p的结合位点,usp13是miR-130b-3p的靶基因。结论:***13是miR-130b-3p的靶基因。2.乳腺癌细胞MCF-7的迁移及侵袭能力在usp13过表达后明显受到抑制。

关键词： usp13 乳腺癌迁移侵袭 miR-130b-3p

去泛素化酶usp13促进NLRP3炎症小体活化机制研究

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去泛素化酶USP13促进NLRP3炎症小体活化机制研究

作者：陶守松天津大学

学位级别：硕士

核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)是机体重要的胞内感应器,可以识别多种病原相关分子和损伤相关分子,激活后与ASC及Pro-Caspase-1形成NLRP3炎症小体,促进IL-1β和IL-18等炎性介质的成熟和分泌,从而促进炎症反应。NLRP3炎症小... 详细信息

核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)是机体重要的胞内感应器,可以识别多种病原相关分子和损伤相关分子,激活后与ASC及Pro-Caspase-1形成NLRP3炎症小体,促进IL-1β和IL-18等炎性介质的成熟和分泌,从而促进炎症反应。NLRP3炎症小体是宿主抵抗病原体入侵的重要屏障,但其异常活化与冷吡啉相关周期性综合征、阿尔兹海默症、非酒精性脂肪肝病、关节炎等多种疾病的发生发展密切相关。NLRP3的表达受到转录、翻译和翻译后修饰的调控,其蛋白稳定性的调节对NLRP3活化具有重要意义,但机制尚未完全揭示。泛素特异性蛋白酶13(usp13)是usp去泛素化酶家族的成员之一,主要发挥去第48位赖氨酸(lys48,K48)位泛素链的功能,抑制其底物通过泛素蛋白酶体途径降解。本论文利用usp13敲除小鼠研究发现,缺失usp13显著抑制小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)中NLRP3炎症小体的活化,表现为降低NLRP3激动剂诱导的IL-1β的分泌、抑制Caspase-1及IL-1β前体的剪切成熟、以及阻断NLRP3炎症小体的组装,包括ASC斑点形成及NLRP3与ASC相互作用。在293T细胞中利用免疫共沉淀实验证明usp13与NLRP3存在相互作用,usp13结合在NLRP3蛋白N端6-89位氨基酸区域(6-89aa),而NLRP3结合在usp13蛋白C端624-863aa区域。过表达usp13选择性去除NLRP3 K48位泛素化链,延长NLRP3蛋白半衰期,提高NLRP3蛋白稳定性。在BMDMs中,敲除usp13显著提高静息状态NLRP3泛素化修饰,抑制LPS诱导的NLRP3 K48位去泛素化,从而降低NLRP3蛋白稳定。本论文发现了usp13调控NLRP3炎症小体活化的新功能,揭示了维持NLRP3蛋白稳定性的新机制,可能为NLRP3相关疾病提供潜在的治疗靶点。

关键词： NLRP3 usp13 去泛素化稳定性