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uri和数字对象唯一标识符

现代图书情报技术 2003年第2期 9-12,60页

作者：毛军张晓林曾蕾李广建刘炜国家科学数字图书馆开放描述项目组北京100080

数字对象唯一标识符作为数字图书馆的基础设施 ,具备网络环境下数字对象的标识、定位、管理等多种职能。本文分析了唯一标识符的类型、组成和构造原则 ,从逻辑标识、命名域相关、复杂性、完整性和互操作等角度论述唯一标识符的需求。在 ... 详细信息

数字对象唯一标识符作为数字图书馆的基础设施 ,具备网络环境下数字对象的标识、定位、管理等多种职能。本文分析了唯一标识符的类型、组成和构造原则 ,从逻辑标识、命名域相关、复杂性、完整性和互操作等角度论述唯一标识符的需求。在 W3C提供的 uri背景下 ,比较 uri、URL和 URN,并分析了相关命名语法和标识框架。最后介绍了 COOL URL的概念和命名需求。

关键词： uri DOI UPL URN COOL URL

uri基因沉默对乳腺癌细胞自噬与凋亡的影响

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医学研究生学报 2021年第10期34卷 1030-1037页

作者：戴万辉谢劲松南京中医药大学附属南京医院(南京市第二医院)检验科南京210003

目的uri基因作为癌基因在乳腺癌的发病机制中研究较少。文中旨在探究癌基因uri沉默后对乳腺癌细胞自噬和凋亡的影响。方法利用RNA干扰(RNAi)技术,抑制uri基因在乳腺癌细胞中的表达。针对人乳腺癌细胞uri的cDNA序列设计,合成3对核苷酸序... 详细信息

目的uri基因作为癌基因在乳腺癌的发病机制中研究较少。文中旨在探究癌基因uri沉默后对乳腺癌细胞自噬和凋亡的影响。方法利用RNA干扰(RNAi)技术,抑制uri基因在乳腺癌细胞中的表达。针对人乳腺癌细胞uri的cDNA序列设计,合成3对核苷酸序列siRNAs(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3),从3对序列中筛选最有效的干扰序列。分为空白对照组(不添加任何转染试剂)、NC-siRNA组(阴性对照FAM-NC-siRNA)、siRNA-uri组(uri基因沉默)。RT-PCR检测自噬相关基因LC3、P62、Beclin1、ATG12和凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3的转录水平,Western blot检测自噬相关蛋白LC3、P62和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达水平,激光共聚焦显微镜检测自噬小体数量的变化,流式细胞仪检测细胞的凋亡。结果确定50 nmol/L为siRNA的最佳转染浓度,siRNA-3为最佳干扰序列。siRNA-uri组自噬相关基因LC3、Beclin1及ATG12的mRNA表达水平明显低于NC-siRNA组(Puri组抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表达水平明显低于NC-siRNA组(Puri组Bcl-2蛋白表达量较NC-siRNA组明显降低,Bax和Caspase-3蛋白表达量明显升高;siRNA-uri组与NC-siRNA组几乎不表达Cleaved Caspase-3蛋白;用250μmol/L H_(2)O_(2)作用于细胞24 h诱导凋亡发生时,siRNA-uri组Bcl-2蛋白表达量较NC-siRNA组显著降低,Bax和Caspase-3蛋白表达量显著升高;两组均表达了Cleaved Caspase-3蛋白,且siRNA-uri组Cleaved Caspase-3蛋白表达量较NC-siRNA组显著升高。结论uri基因沉默可导致乳腺癌细胞自噬减弱和凋亡增强,为探究乳腺癌的治疗手段提供了实验依据。

关键词： uri 乳腺癌细胞自噬凋亡

以领先技术探寻水资源解决之路访IDE海水淡化技术有限公司全球市场总监uri Kerstein先生

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工业水处理 2011年第6期31卷 95-96页

作者：霍文敏《工业水处理》编辑部

我国是水资源大国,同时也是水资源贫国。淡水资源短缺已经严重制约了沿海地区社会经济的发展。海水作为水资源重要组成部分,其有效利用是解决我国水资源危机的重要措施之一。海水淡化已成为我国沿海地区解决淡水危机的重要战略选择。为... 详细信息

我国是水资源大国,同时也是水资源贫国。淡水资源短缺已经严重制约了沿海地区社会经济的发展。海水作为水资源重要组成部分,其有效利用是解决我国水资源危机的重要措施之一。海水淡化已成为我国沿海地区解决淡水危机的重要战略选择。为此,我们对海水淡化专业技术公司以色列IDE公司进行了专访,并与IDE公司全球市场总监uri Kerstein先生进行了深入的探讨。

关键词：海水淡化技术水资源短缺全球市场 IDE uri 总监沿海地区水资源危机

uri通过ATM/CHK2通路调控顺铂诱导的胃癌细胞DNA损伤修复的研究

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URI通过ATM/CHK2通路调控顺铂诱导的胃癌细胞DNA损伤修复的研究

作者：卞慧琴江苏大学

学位级别：硕士

研究背景胃癌是最常见的胃肠道恶性肿瘤之一,死亡率仅次于肺癌和肝癌。临床上早期胃癌的确诊率低,中晚期主要采用手术切除联合化疗或单纯化疗方案。胃癌易发生化疗耐药,严重影响预后。顺铂是胃癌化疗药物之一,胃癌对顺铂的耐药限制了其... 详细信息

研究背景胃癌是最常见的胃肠道恶性肿瘤之一,死亡率仅次于肺癌和肝癌。临床上早期胃癌的确诊率低,中晚期主要采用手术切除联合化疗或单纯化疗方案。胃癌易发生化疗耐药,严重影响预后。顺铂是胃癌化疗药物之一,胃癌对顺铂的耐药限制了其应用。相关研究已经证实非常规前折叠素RPB5作用因子uri是一个癌蛋白,与RPB5结合后能够参与调控基因转录。我们的前期研究发现uri增加多种癌细胞对常见化疗药物的抵抗,降低重铬酸钾导致的DNA损伤并促进损伤后的修复,对线虫和果蝇的研究也揭示uri能够一定程度上维护基因组的稳定性,而近年来对顺铂的耐药机制的研究发现DNA损伤修复的增加是肿瘤细胞顺铂耐药的原因之一。因此,本文主要以uri在胃癌细胞DNA损伤修复中的作用为切入点探讨影响胃癌细胞顺铂耐药性的机制。研究目的以人低分化胃癌MGC-803细胞株和来源于低分化胃癌淋巴结转移病灶的SGC-7901细胞株为研究对象,通过对两株细胞uri的敲低,探究顺铂作用下uri对胃癌细胞耐药性及DNA损伤修复的影响,探索uri是否通过ATM/CHK2修复通路促进胃癌细胞的DNA损伤修复,进一步探明uri影响胃癌细胞耐药性的潜在机制。研究方法(1)采用转染试剂Hiperfect分别在人胃癌细胞MGC-803和SGC-7901中瞬转uri特异性小干扰片段siRNA-A构建uri干扰细胞株,以转染无关序列片段组和未转染组为对照,用qRT-PCR和Western blot分别检测各组细胞中uri在mRNA和蛋白水平的表达量,对uri敲低细胞株的构建进行验证。(2)彗星实验检测不同浓度顺铂作用下细胞的DNA损伤,Western blot检测uri敲低组与各对照组在有无顺铂作用下的γH2AX表达情况。(3)CCK-8法检测不同浓度顺铂作用下各组细胞的细胞活力,并根据活力值计算顺铂的IC50;EDU法检测各组细胞在顺铂作用下的增殖情况。(4)流式细胞术检测顺铂处理后uri敲低组与对照组细胞的凋亡。(5)Western blot检测顺铂处理后的各组细胞在0h、6h、12h修复时间时,细胞DNA损伤修复通路相关蛋白的表达量及磷酸化水平。(6)流式细胞术检测顺铂作用下的各组细胞经12h修复后的周期分布情况。研究结果(1)siRNA-A转染后胃癌细胞uri的表达qRT-PCR和Western blot结果显示,转染uri干扰片段siRNA后,MGC-803和SGC-7901细胞中uri的mRNA和蛋白水平表达量与对照组相比均显著降低。(2)顺铂可导致胃癌细胞DNA损伤且uri敲低后损伤增加彗星实验中,顺铂作用后两株细胞的OTM值均增加,且随着顺铂作用浓度的增加呈递增趋势,说明随着顺铂浓度增加,DNA的损伤程度增加;Western blot检测出顺铂作用后各组细胞的γH2AX水平升高,且顺铂处理后的uri敲低组细胞γH2AX表达量与对照组相比明显增加,表明uri能减少顺铂导致的胃癌细胞DNA损伤。(3)敲低uri减弱胃癌细胞活力与增殖能力CCK-8检测结果显示与对照组相比,uri敲低组胃癌细胞活力降低,顺铂的IC50值降低,说明uri增加了胃癌细胞对顺铂的抵抗;EDU结果显示顺铂作用下,敲低uri减弱了细胞的增殖能力。(4)uri减弱顺铂诱导的胃癌细胞凋亡顺铂作用后的胃癌细胞经流式细胞术检测显示,uri敲低后MGC-803细胞的早期凋亡与对照组相比明显增加,SGC-7901细胞的晚期凋亡明显增加,二者的总凋亡率均明显增高。(5)uri影响顺铂作用下胃癌细胞DNA损伤修复通路相关蛋白的表达顺铂处理后的各组细胞与未处理组相比,DNA损伤修复通路中的P-ATM和P-CHK2水平明显升高;顺铂作用后,给予细胞0h和6h的修复时间,uri敲低组胃癌细胞P-ATM和P-CHK2水平与对照组相比无明显差异,而修复时间为12h时,uri敲低组细胞P-ATM和P-CHK2水平较对照组均明显降低,说明uri敲低细胞中ATM/CHK2修复通路活性降低。(6)uri促进顺铂诱导的胃癌细胞DNA损伤的修复无顺铂作用时,敲低uri对胃癌细胞周期中各期所占比例影响不大,而顺铂作用4小时且修复12小时后,uri敲低组细胞与对照组相比出现G1期阻滞。这提示uri可减少顺铂导致的DNA的损伤,增加修复能力,促进细胞通过G1期进入分裂状态,增强细胞的耐药性。结论(1)uri能减少顺铂诱导的胃癌细胞DNA损伤,并促进损伤后的修复。(2)uri通过ATM/CHK2修复通路,增强胃癌细胞DNA损伤修复能力,增加细胞对顺铂的耐药性。

关键词： uri 胃癌细胞顺铂耐药性 DNA损伤修复

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uri敲低诱导胃癌细胞自噬及其机制的研究

URI敲低诱导胃癌细胞自噬及其机制的研究

作者：张飞江苏大学

学位级别：硕士

研究背景uri(Unconventional prefoldin RPB5 Interactor)是进化上保守的前折叠素家族成员之一,是RNA聚合酶II亚型5作用蛋白,介入营养敏感的m TOR依赖的转录程序的调节。多项研究表明uri是一个癌基因。我们前期实验表明uri可促进胃癌MGC... 详细信息

研究背景uri(Unconventional prefoldin RPB5 Interactor)是进化上保守的前折叠素家族成员之一,是RNA聚合酶II亚型5作用蛋白,介入营养敏感的m TOR依赖的转录程序的调节。多项研究表明uri是一个癌基因。我们前期实验表明uri可促进胃癌MGC-803、HGC-27细胞的存活和迁移,增强对化疗药物的耐药性。自噬是一个吞噬本身损伤细胞器和蛋白,经过溶酶体参与的降解,保持营养循环的代谢进程。肿瘤中自噬的生物学意义非常复杂,即便在同一种肿瘤研究中也会得出不同结论。但普遍的认识是自噬在肿瘤的发生、发展、耐药和靶向治疗中可能有重要意义,靶向自噬治疗肿瘤的实验研究展示了临床应用的前景。有研究发现PI3K/Akt/mTOR通路蛋白过表达对胃癌的预后具有潜在意义。由于uri是m TOR通路相关分子,我们推测uri参与了自噬的调节。本文将探索uri对胃癌MGC-803和HGC-27细胞自噬的调控及其机制。研究目的探究uri是否参与胃癌细胞自噬的调节及其机制。研究方法(1)胃癌细胞培养本研究中我们用低分化的MGC-803胃癌细胞和未分化的HGC-27胃癌细胞作为研究对象。两种细胞分别培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基和RPMI-1640培养基。(2)uri的过表达和敲低通过分别转染pCMV6-uri质粒和uri siRNA-A干扰片段建立uri过表达的和敲低表达的胃癌MGC-803和HGC-27细胞株。用荧光定量PCR法和免疫印迹法检测胃癌细胞MGC-803和HGC-27中uri的mRNA表达水平和蛋白表达水平,验证干预效果。(3)胃癌细胞自噬检测转染GFP-LC3,激光共聚焦显微镜观察细胞胞浆中明亮的绿色荧光斑点,评估LC3蛋白的定位和转化;用透射电镜察看细胞自噬泡形态状况;在联合使用NHCl抑制溶酶体与自噬小体融合的情况下,通过免疫印迹法分析LC3-II/LC3-I比值改变,评估胃癌细胞的自噬流水平。(4)Western blot法检测mTOR、p70S6K磷酸化水平在干预uri表达的情况下通过western blot法检测mTOR、p70S6K和磷酸化mTOR、磷酸化p70S6K1表达水平,探索uri调控胃癌细胞自噬的机制。研究结果(1)干预uri表达的胃癌细胞株构建转染pCMV6-uri质粒的胃癌细胞中uri表达量显著升高,转染uri siRNA-A沉默片段的胃癌细胞中uri的表达水平明显下降,表明干扰uri表达的胃癌细胞株构建成功。(2)uri siRNA-A转染诱导GFP-LC3转位至自噬体膜激光共聚焦显微镜观察到敲低uri的胃癌细胞中明亮的绿色荧光斑点增多,但经3-MA,一种自噬早期抑制剂处理后绿色荧光斑点减少,表明随着自噬体形成,GFP-LC3转位至自噬小体的膜上。(3)uri siRNA-A转染诱导自噬囊泡形成用透射电镜观察到敲低uri表达的胃癌细胞中自噬囊泡增多。相反,在无关序列转染的细胞和经3-MA处理的siRNA-A转染细胞中自噬囊泡少见。这进一步提示敲低uri表达可以促进胃癌细胞自噬小体的形成。(4)uri敲低后增强细胞自噬流通过western blot分析显示,同单纯敲低uri的细胞以及同敲低uri+雷帕霉素处理的细胞相比,在添加溶酶体抑制剂NHCL处理后上述两种细胞的LC3-II/LC3-I比值显著升高,表明敲低uri表达可促进胃癌细胞的自噬过程,即自噬流是增强的。(5)uri调节mTOR、p70S6K的磷酸化水平在MGC-803和HGC-27两株胃癌细胞中,转染过表达质粒uri后,同对照组相比,P-mTOR和P-p70S6K的表达水平增加;敲低uri后,P-mTOR和P-p70S6K的蛋白表达水平减低。结论(1)uri敲低诱导MGC-803和HGC-27胃癌细胞的自噬。(2)uri敲低诱导胃癌细胞自噬的机制可能涉及uri对mTOR/p70S6K通路的调节。

关键词： uri 基因敲低人胃癌细胞自噬 mTOR/p70S6K通路

uri抑制重铬酸钾诱导的SGC-7901细胞氧化应激、DNA损伤及其机制

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URI抑制重铬酸钾诱导的SGC-7901细胞氧化应激、DNA损伤及其机制

作者：罗东为江苏大学

学位级别：硕士

研究背景:铬(chromium,Cr)是一种天然的元素,在大气,土壤,岩石,微生物,植物以及动物体内都有发现。它主要以三价铬[Cr(III)]和六价铬[Cr(VI)]这两种价态的形式存在于自然界。其中Cr(VI)是已知的致癌剂。工业生产过程中的Cr(VI)是导致工... 详细信息

研究背景:铬(chromium,Cr)是一种天然的元素,在大气,土壤,岩石,微生物,植物以及动物体内都有发现。它主要以三价铬[Cr(III)]和六价铬[Cr(VI)]这两种价态的形式存在于自然界。其中Cr(VI)是已知的致癌剂。工业生产过程中的Cr(VI)是导致工人职业性肺癌的重要原因。长期暴露在污染的Cr(VI)环境中会对人体健康产生严重的危害,如肝肾器官损害、接触性皮炎、皮肤癌等。Cr(VI)导致的细胞氧化应激和DNA损伤是肿瘤形成的主要原因。除肺癌外,Cr(VI)还可导致消化道肿瘤等,但其具体机制还有待研究。uri(unconventional prefoldin RPB5 interactor,uri)属于前折叠素家族,可以与RNA聚合酶的亚基RPB5蛋白结合,主要参与多种基因转录水平的调控。研究结果表明,uri对维护线虫和果蝇基因组的稳定性发挥重要的作用,uri沉默后,会导致DNA损伤的累积从而导致细胞凋亡。uri也被认为是一个促癌蛋白,能够促进多种肿瘤细胞的增殖,并抵抗细胞凋亡。研究还发现uri是一种放射敏感蛋白。而重铬酸钾是一种常见的Cr(VI)盐,已被证实是一种化学致癌剂,但对其致癌机制目前尚不清楚。研究目的:对正常细胞而言,重铬酸钾具有细胞毒性和致瘤性。但肿瘤细胞对重铬酸钾处理后会有什么反应?面对细胞毒性,加强DNA损伤的修复和逃避死亡是肿瘤细胞的特性,而uri是一个癌蛋白,uri在重铬酸钾诱导的肿瘤细胞氧化应激﹑DNA损伤等过程中是否具有保护作用?本研究通过敲低SGC-7901细胞中uri的表达,研究在重铬酸钾诱导SGC-7901细胞ROS产生,DNA损伤及修复,细胞死亡过程中uri的作用,进一步丰富对uri功能的理解,也为uri在重铬酸钾诱导肿瘤的形成过程提供新的思路。研究方法:(1)应用si RNA沉默技术在人胃癌细胞SGC-7901中敲低uri,设置si RNA-A干扰组,Scrambled无关序列组和Blank空白组。并采用免疫印迹方法检测其表达水平,验证uri敲低效果。(2)用DCH-DA试剂盒分别用流式以及荧光方法检测上述各组细胞在重铬酸钾作用后细胞内DCF的荧光强度,以此反映细胞ROS水平。(3)用彗星实验检测各组细胞在相应重铬酸钾处理后的OTM值,设置重铬酸钾的浓度(1μM,10μM),用OTM值反映细胞DNA损伤程度及修复效率。(4)用Annexin V/PI染色试剂盒通过流式细胞术检测各组细胞在重铬酸钾处理后的细胞凋亡及坏死。(5)免疫印迹和免疫荧光方法检测各组细胞在重铬酸钾处理后相应蛋白的表达,包括抗凋亡蛋白Bcl-2,Mcl-1和促凋亡蛋白Bax以及凋亡诱导因子AIF等。(6)NAD+测定试剂盒检测各组细胞在相应重铬酸钾处理后细胞中NAD+的含量。研究结果:(1)uri干扰后,重铬酸钾诱导SGC-7901细胞的ROS产生明显增加。(2)uri干扰后,重铬酸钾诱导SGC-7901细胞的DNA损伤明显增加,且在相对高浓度的重铬酸钾作用SGC-7901细胞后,uri干扰后抑制了细胞对DNA损伤修复的能力。(3)相对低浓度的重铬酸钾导致SGC-7901细胞的死亡主要是依赖线粒体途径的凋亡,而相对高浓度重铬酸钾作用SGC-7901细胞主要是依赖PARP1途径的坏死。并且uri干扰后,这两种细胞的死亡都明显增加。结论:(1)uri能够抑制重铬酸钾诱导的细胞ROS产生,说明uri参与了重铬酸钾诱导细胞氧化应激的调节。(2)uri能降低重铬酸钾诱导的细胞DNA损伤,uri干扰后显著抑制了细胞在10μM浓度重铬酸钾作用后DNA损伤的修复效率。提示uri能影响重铬酸钾诱导的细胞DNA损伤及其修复。(3)uri对重铬酸钾作用下的细胞存活发挥作用,uri能抵抗重铬酸钾诱导的细胞死亡。

关键词： uri 胃癌细胞SGC-7901 重铬酸钾活性氧自由基 DNA损伤与修复细胞死亡

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uri在肝细胞癌中的表达及其临床意义

URI在肝细胞癌中的表达及其临床意义

作者：金龙飞山西医科大学

学位级别：硕士

目的:通过收集患者的临床相关数据,对HCC组织中uri的表达情况与临床变量的相关性进行分析,研究uri的表达水平及其在肝癌诊断、预后方面的临床意义。方法:前期通过TCGA和CPTAC数据库进行生信分析发现uri可能在HCC的生物学行为中扮演着重... 详细信息

目的:通过收集患者的临床相关数据,对HCC组织中uri的表达情况与临床变量的相关性进行分析,研究uri的表达水平及其在肝癌诊断、预后方面的临床意义。方法:前期通过TCGA和CPTAC数据库进行生信分析发现uri可能在HCC的生物学行为中扮演着重要的作用,接着收集山西白求恩医院病理科2014年1月——2020年10月外科手术切除后组织病理学诊断为“肝细胞肝癌”的组织标本和配对癌旁非肿瘤组织各48例,通过IHC定量检测uri在HCC和正常组织中的表达水平,比较uri在肝癌组织和正常肝脏组织的表达差异,并分析uri在HCC中的表达水平与临床数据的相关性,探讨uri对肝癌患者在疾病进展、预后方面的影响。结果:(1)通过IHC实验证实uri在HCC中主要表达于细胞质和胞浆,通过计算患者的MD值,得出HCC癌组织的表达量(0.207±0.0127)高于正常肝脏组织的uri表达量(0.194±0.0148),差异具有统计学意义(Puri表达水平与临床特征的相关性的分析中我们发现uri在HCC癌组织中的表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、AFP水平、血管浸润、神经浸润、肿瘤数量、HBs Ag状态、吸烟史、饮酒史、肿瘤体积、生存状态、生存期等临床相关指标差异无统计学意义(P>0.05)。而uri的表达水平高低与肝癌患者术后有无复发相关,uri高表达组的肝癌术后患者复发率高(P=0.036),差异具有统计学意义(Puri在HCC组织相对于正常肝脏组织呈高表达,其表达量和HCC患者术后肿瘤复发存在相关性。

关键词： uri 免疫组化肝细胞癌诊断预后

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uri促进胃癌细胞阿霉素耐药性和细胞迁移

URI促进胃癌细胞阿霉素耐药性和细胞迁移

作者：胡小霞江苏大学

学位级别：硕士

研究背景:胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,在导致死亡的肿瘤中排第二。超过70%的诊断和死亡发生于发展中国家,尤其以中国的发病率最高。早期胃癌的治疗常采取外科手术切除,但是大部分胃癌被确诊时已经是晚期,并且发生了转移,错过了... 详细信息

研究背景:胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,在导致死亡的肿瘤中排第二。超过70%的诊断和死亡发生于发展中国家,尤其以中国的发病率最高。早期胃癌的治疗常采取外科手术切除,但是大部分胃癌被确诊时已经是晚期,并且发生了转移,错过了手术治疗的最佳时间。晚期患者预后不良,五年生存率不到15%。为了改善其生命质量和延长生命,联合化疗是最主要的方法。由于药物抵抗及复发转移,胃癌病人的预后不容乐观。因此,需要寻找有效可行的方法来解决胃癌对化疗药物抵抗和复发转移等问题。非常规前折叠素RPB5作用因子uri,是RNA聚合酶II亚型5的作用蛋白,参与营养敏感m TOR依赖的转录程序的调控,多项研究已经表明uri是一个癌蛋白。然而,uri是否在胃癌肿瘤形成中起作用目前还未阐明。在胃癌细胞中,PI3K/Akt/m TOR通路过表达,对胃癌的预后具有潜在意义。本文我们探索uri对胃癌细胞MGC-803和HGC-27的作用,主要针对阿霉素抵抗和细胞迁移及其机制的研究。研究目的:本文研究uri对MGC-803和HGC-27细胞生物学特征的作用,主要探索uri对胃癌细胞阿霉素耐药性和迁移能力的影响。研究方法:(1)细胞培养胃癌细胞MGC-803培养于DMEM培养基内,HGC-27细胞采用RPMI-1640培养基培养,培养基中均含10%胎牛血清及1%青霉素和链霉素的混合物,细胞于37℃5%CO2培养箱中对数生长。(2)过表达或敲低uri免疫印迹法检测SGC-7901、HGC-27、MGC-803和BGC-823细胞uri的表达,选择MGC-803和HGC-27细胞进行下一步实验。过表达胃癌细胞uri采用脂质体2000瞬时转染uri表达质粒p CMV6-uri,敲低细胞uri通过瞬转uri干扰片段si RNA-A、si RNA-B和si RNA-C实现。荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法用于检测uri在m RNA和蛋白水平的表达。(3)细胞增殖实验CCK-8法检测uri过表达和敲低后,在有无阿霉素作用下的细胞增殖。(4)凋亡相关蛋白的表达及凋亡分析蛋白免疫印迹法检测过表达和敲低uri凋亡相关蛋白的水平,流式细胞技术检测阿霉素处理下敲低uri细胞的凋亡。(5)细胞迁移实验Transwell小室实验了解转染细胞的迁移能力,免疫印迹法检测EMT相关蛋白Vimentin和Snail的表达。研究结果:(1)uri在胃癌细胞中的表达免疫印迹法显示四株胃癌细胞均有uri表达,我们选择低分化的MGC-803细胞和未分化的HGC-27细胞进行接下来的实验。转染p CMV6-uri质粒细胞的uri表达明显升高,转染uri si RNA干扰片段细胞uri的水平显著降低,其中uri si RNA-A的敲低效果最强。(2)uri促进胃癌细胞增殖转染p CMV6-uri过表达uri促进两株细胞的增殖,敲低uri显著减弱细胞增殖。(3)uri拮抗阿霉素对细胞增生的抑制,减弱其诱导的凋亡CCK-8试剂盒用于检测细胞的增殖。转染p CMV6-uri细胞阿霉素的IC50值明显增高,敲低uri其值降低。阿霉素处理后,过表达uri细胞的Bax/Bcl-2相对比值、裂解的PARP-1和Caspase-3水平均降低。相反,敲低uri增加两株细胞Bax/Bcl-2相对比值、裂解的PARP-1和Caspase-3的水平。与对照组相比,阿霉素处理敲低uri的细胞,早期凋亡(Annexin V+/PI-)在两株细胞中均显著增加。(4)uri促进细胞迁移能力及增加Vimentin和Snail的表达在两株胃癌细胞中,转染p CMV6-uri增强细胞的迁移能力,引起EMT标志物Vimentin和Snail的表达增加。转染uri si RNA减弱细胞迁移,Vimentin和Snail的表达均显著减低。结论:(1)uri能促进胃癌细胞的增殖能力。(2)uri通过促进细胞增殖增强药物抵抗,通过Caspase依赖的方式抑制细胞凋亡。(3)uri可能通过上调EMT相关蛋白Vimentin和Snail的表达促进细胞迁移。

关键词： uri 胃癌细胞药物抵抗阿霉素细胞迁移

uri通过调控Vimentin表达增强宫颈癌细胞迁移与侵袭能力的研究

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URI通过调控Vimentin表达增强宫颈癌细胞迁移与侵袭能力的研究

作者：许忠海江苏大学

学位级别：硕士

研究背景宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤,是威胁广大发展中国家女性生命健康的重要疾病。宫颈癌一旦发生远端转移,将严重影响患者的生存率和治愈效果。因此,宫颈癌转移机制的研究被持续重点关注。RNA聚合酶2第五亚基(RPB5)作用蛋... 详细信息

研究背景宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤,是威胁广大发展中国家女性生命健康的重要疾病。宫颈癌一旦发生远端转移,将严重影响患者的生存率和治愈效果。因此,宫颈癌转移机制的研究被持续重点关注。RNA聚合酶2第五亚基(RPB5)作用蛋白RMP,即非经典前折叠素RPB5作用因子uri具有癌蛋白的特性,本课题组的前期研究显示在体外,uri能够促进宫颈癌细胞的迁移,但具体机制不明,推测可能与细胞骨架波形蛋白(Vimentin)有关。在前期研究工作的基础上,本研究以宫颈癌细胞株He La和C33A为研究对象,通过干预uri和Vimentin的表达,进一步探讨uri对宫颈癌细胞迁移和侵袭的作用及机制,并探讨uri与Vimentin之间的关系。研究目的本研究主要有三个目的:(1)探究uri对两株宫颈癌细胞He La和C33A迁移和侵袭的生物学行为的作用。(2)揭示uri对宫颈癌细胞运动能力的影响是否与Vimentin有关。(3)探索uri对Vimentin调控的潜在机制。研究方法(1)采用q RT-PCR和western blot检测两株宫颈癌细胞中uri的基础表达水平,然后在He La和C33A细胞中,运用化学转染试剂分别转染uri特异性si RNA、uri表达质粒PCMV6-uri以构建uri干扰和过表达细胞株。(2)运用Transwell小室实验检测uri敲低或过表达后细胞的迁移和侵袭能力。(3)在He La和C33A细胞中,分别敲低或过表达uri后运用q RT-PCR和western blot检测分析Vimentin的表达情况。(4)在uri干预的宫颈癌细胞中,分别用TGF-β、Vimentin特异性si RNA诱导或敲低Vimentin表达后观察细胞的运动能力。(5)将Vimentin基因上游启动子序列克隆到带有荧光素酶报告基因的p GL3/Basic载体中,通过与uri表达质粒共转染293T细胞,荧光素酶报告实验检测uri对Vimentin启动子活性的影响。(6)使用染色质免疫共沉淀(Ch IP)实验分析uri在Vimentin基因启动子区域的可能结合情况。研究结果(1)两株宫颈癌细胞uri基础表达水平和细胞转染研究:q RT-PCR和western blot检测结果显示,He La细胞uri的基础表达水平比C33A细胞高。转染uri特异性si RNA后,He La细胞uri的m RNA和蛋白表达水平明显低于对照组,而转染uri表达质粒PCMV6-uri后,C33A细胞uri的m RNA和蛋白表达水平明显高于对照组。(2)干预uri可影响细胞迁移和侵袭能力:Transwell小室迁移实验显示,在He La细胞中,uri干扰组比对照组细胞迁移穿过小室的数目明显减少:在C33A细胞中,uri过表达组比对照组细胞迁移穿过小室的数目明显增多。Transwell小室侵袭实验显示,同对照组相比,uri干扰后He La细胞侵袭穿过小室的数目明显减少;而过表达uri后C33A细胞侵袭穿透小室的数目明显增多。(3)干预uri可调控Vimentin的表达:q RT-PCR和western blot检测表明,同对照组相比,uri干扰后,He La细胞内Vimentin的m RNA和蛋白表达水平表达都下降;uri过表达后,C33A细胞内Vimentin的m RNA和蛋白表达水平都增加。(4)uri对细胞迁移和侵袭能力的影响同Vimentin有关:Transwell小室迁移实验显示,在uri干扰的He La细胞中,经10ng/ml TGF-β处理后,细胞迁移穿过小室的数目比未处理组多;在uri过表达的C33A细胞中,经Vimentin特异性si RNA转染后的,细胞迁移穿过小室的数目比对照组少。Transwell小室侵袭实验显示,在uri干扰的He La细胞中,10ng/ml TGF-β处理组细胞侵袭穿过小室的数目明显比未处理组多;在uri过表达的C33A细胞中,Vimentin特异性si RNA转染组细胞侵袭穿过小室的数目明显比对照组少。(5)uri可间接活化Vimentin启动子活性:在293T细胞中,荧光素酶报告实验结果显示uri过表达组的荧光素酶活性比对照组增强了约1.57倍,但在He La和C33A两株宫颈癌细胞中,运用染色质免疫共沉淀实验分析,q PCR结果显示uri蛋白在Vimentin启动子各区域结合情况同阴性对照组相比没有统计学差异。结论(1)uri可促进宫颈癌细胞迁移和侵袭。(2)uri可增强Vimentin的m RNA和蛋白表达。(3)Vimentin有助于uri增强宫颈癌细胞的运动能力。(4)uri可增强Vimentin启动子的活性,但尚无证据表明其可以直接结合到Vimentin启动子上。

关键词： uri 宫颈癌细胞迁移侵袭波形蛋白转化生长因子-β 荧光素酶报告基因染色质免疫共沉淀