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usp39在乳腺癌中的表达及其与乳腺癌临床病理指标的相关性研究

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USP39在乳腺癌中的表达及其与乳腺癌临床病理指标的相关性研究

作者：孙明青岛大学

学位级别：硕士

目的:1.检测usp39蛋白和基因在乳腺癌组织中的表达水平。2.分析usp39蛋白和基因表达与乳腺癌临床病理指标的关系。方法:1.选取68例乳腺癌组织、20例乳腺正常组织,通过免疫组化方法检测两组中usp39蛋白的表达,分析usp39蛋白表达与乳腺癌... 详细信息

目的:1.检测usp39蛋白和基因在乳腺癌组织中的表达水平。2.分析usp39蛋白和基因表达与乳腺癌临床病理指标的关系。方法:1.选取68例乳腺癌组织、20例乳腺正常组织,通过免疫组化方法检测两组中usp39蛋白的表达,分析usp39蛋白表达与乳腺癌临床病理特点的关系。2.选取108例乳腺癌组织和配对的癌旁非癌组织,通过实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测usp39m RNA的表达,分析usp39基因表达与乳腺癌临床病理特点的关系。结果:***39蛋白在乳腺癌组织中表达的阳性率为69.12%（47/68）,在正常组织中阳性率为30.00%（6/20）,P=0.002,两者之间差异具有统计学意义。usp39蛋白的表达与乳腺癌组织学分级和癌组织中KI67的表达有关（P＜0.05）。***39基因在乳腺癌组织中表达水平高于癌旁组织,差异具有统计学意义,P=0.021。usp39基因的表达与乳腺癌患者年龄、乳腺癌组织学分级、临床分期及癌组织中KI67的表达有关（P＜0.05）。结论:***39在乳腺腺癌组织中呈高表达状态。***39的高表达与乳腺癌患者预后不良的一些临床病理指标相关,usp39可能在乳腺癌的发生发展中发挥作用。

关键词：乳腺癌 usp39 免疫组化 Real-time PCR

usp39表达与乳腺癌新辅助化疗疗效相关性的研究

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USP39表达与乳腺癌新辅助化疗疗效相关性的研究

作者：张素玲青岛大学

学位级别：硕士

目的:新辅助化疗(Neoadjuvant chemotherapy,NAC)已是局部晚期乳腺癌的标准治疗方式,也适用于绝大多数需要术后辅助化疗的早期乳腺癌患者。新辅助化疗后获得病理完全缓解(pCR,即原发灶和转移淋巴结均无恶性肿瘤细胞残留)的患者预后较好... 详细信息

目的:新辅助化疗(Neoadjuvant chemotherapy,NAC)已是局部晚期乳腺癌的标准治疗方式,也适用于绝大多数需要术后辅助化疗的早期乳腺癌患者。新辅助化疗后获得病理完全缓解(pCR,即原发灶和转移淋巴结均无恶性肿瘤细胞残留)的患者预后较好,无病生存期长。usp39属于泛素特异性蛋白酶家族(ubiquitin-specific protease,usps),主要参与mRNA的剪切,具有维持有丝分裂纺锤体检验点的完整性的功能,确保细胞的成功分裂。前期研究已证实usp39具有促进乳腺癌细胞增殖的作用。但usp39的表达能否评价乳腺癌新辅助化疗疗效国内外研究甚少。本实验通过对乳腺癌接受新辅助化疗患者的穿刺标本进行免疫组化检测,分析新辅助化疗疗效与usp39蛋白的表达的相关性,探讨usp39表达能否预测乳腺癌新辅助化疗pCR,以期更好指导乳腺癌的临床治疗。方法:收集于2016年1月-2017年12月就诊于青岛大学附属医院乳腺病诊疗中心,接受新辅助化疗的患者122例。根据纳入?排除标准,符合纳入标准的女性乳腺癌患者98例,根据化疗疗效评价Miller and Payne组织学分级系统分析,其中78例未达病理完全缓解(No-pCR)?20例达到病理完全缓解(pCR)。收集入组患者临床信息及病理学特征信息?新辅助化疗疗效。用免疫组织化学检测新辅助化疗的乳腺癌患者化疗前穿刺?及同一患者手术标本乳腺癌组织中usp39蛋白的表达。免疫组化结果由有经验的病理科老师协助,根据细胞染色强度及阳性细胞百分比数的乘积,进行评分。整理纳入患者临床病理学信息,采用SPSS20.0统计学分析软件,对数据进行分析,免疫组化结果通过卡方检验,频数小于5应用Fisher确切概率法进行统计,Pusp39的表达在经过新辅助化疗后是否存在差异;根据术后病理结果分析,达到不同乳腺癌新辅助化疗疗效的乳腺癌患者,化疗前穿刺组织中usp39的表达差异是否具有统计学意义;同时分析usp39的表达与患者年龄?月经状态?BMI?化疗方案等可能影响新辅助化疗疗效的独立基本信息,及不同肿瘤分级?分子分型?及激素受体?Her-2及Ki67表达水平等可能影响新辅助化疗疗效的病理特征是否相关。分型研究乳腺癌组织中usp39的表达与新辅助化疗疗效是否相关,探索usp39的表达是否能评估新辅助化疗疗效,以及usp39的表达是否能够预测新辅助化疗pCR。结果:研究发现新辅助化疗后,乳腺癌组织中usp39的表达明显降低;同时对达到不同化疗疗效的新辅助化疗乳腺癌患者,术前穿刺标本中usp39的差异性表达进行分析,usp39的表达与乳腺癌新辅助化疗疗效存在明显相关,即usp39高表达的患者更易达到新辅助化疗pCR;同时验证usp39的表达与患者临床信息,即患者的年龄?月经状态?BMI?化疗方案等临床基本信息无明显相关性;usp39的表达与患者新辅助化疗前肿瘤大小?肿瘤组织分级?分子分型等病理特征无明显相关性,进一步分析证实usp39的表达与ER?PR等激素受体水平及Her-2状态的差异未见明显差异(P值均大于0.05);穿刺组织中usp39的表达与Ki67表达相关,usp39在乳腺癌组织中表达与Ki67阳性指数的表达正相关(Pusp39的表达水平在新辅助化疗后明显降低;usp39高表达的患者新辅助化疗更易达到pCR;usp39其表达水平与Ki67表达量呈正相关。因此,证实usp39蛋白的表达与新辅助化疗疗效相关,其表达一定程度上可预测乳腺癌新辅助化疗是否能够达到pCR。

关键词： usp39 乳腺癌新辅助化疗 PCR

usp39、Ki67在鳞癌、鲍温病、日光性角化病中的表达及意义

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USP39、Ki67在鳞癌、鲍温病、日光性角化病中的表达及意义

作者：黄玲珍暨南大学

学位级别：硕士

【目的】探讨去泛素化酶usp39及Ki67在皮肤鳞状细胞癌、鲍温病、日光性角化病中的表达,研究其表达与肿瘤恶性程度、发展的相关性。为了解皮肤鳞状细胞癌、鲍温病、日光性角化病这类肿瘤发生发展及今后靶向治疗提供理论依据。【方法】1.... 详细信息

【目的】探讨去泛素化酶usp39及Ki67在皮肤鳞状细胞癌、鲍温病、日光性角化病中的表达,研究其表达与肿瘤恶性程度、发展的相关性。为了解皮肤鳞状细胞癌、鲍温病、日光性角化病这类肿瘤发生发展及今后靶向治疗提供理论依据。【方法】1.选取病理诊断为皮肤鳞状细胞癌11例,鲍温病、日光性角化病各10例,肿瘤边缘的正常组织作为自身对照。2.经过固定、脱水、包埋、切片等步骤,用免疫组化的方法检测了鳞状细胞癌、鲍温病、日光性角化病组织中Ki67、usp39的表达。在光学显微镜下观察切片,每张切片在病变组织中随机选取5个不连续的视野,采用Immunoreactive score(IRS)评分方法进行评分分级。3.最后通过软件SPSS13.0进行统计分析病种之间usp39、Ki67的表达差异,以及同一病种usp39、Ki67表达的相关性,从而推测usp39及Ki67在皮肤肿瘤发生发展中的作用。实验数据均值按阴性、弱阳性、阳性、强阳性等级表示,对不同疾病组的实验数据均值采用非参数秩和检验中的KruskalWallis H检验方法进行分析,同组疾病的不同指标采用回归和相关方法进行分析,检验水准α=0.05,Pusp39主要在病变组织中表达,正常组织多为阴性,主要为细胞核表达,细胞浆中几乎不表达。2.各组间Ki67表达不同或不全相同,差异有统计学意义(P鲍温病组>日光性角化病组。进一步进行两两比较,鳞状细胞癌组与日光性角化病组、鲍温病组与日光性角化病组差异有统计学意义(P0.05)。鳞状细胞癌中Ki67的阳性表达率为100%(11/11),其中强阳性5例,中等强度阳性4例,弱阳性2例,鲍温病、日光性角化病组织中Ki67强阳性表达只有1例。***39的表达鳞状细胞癌组>鲍温病组>日光性角化病组,然而差异无统计学意义(P>0.05),进一步进行两两比较,鳞状细胞癌组与日光性角化病组差异有统计学意义(P0.05)。4.三组研究中,Ki67及usp39强阳性染色多出现在畸形、分裂像明显、核大的细胞中。Ki67及usp39的表达在日光性角化病组织中的表达有自己的特点:趋向在细胞异常增生的基底部组织中表达,表皮上层多为阴性。5.在鳞状细胞癌组织中Ki67与usp39表达有一定的相关性(Pusp39、Ki67的表达较角化珠内部肿瘤细胞高,肢端、继发于烧伤瘢痕的病变组织中usp39、Ki67的表达较其他部位高。【结论】***67在鳞状细胞癌、鲍温病、日光性角化病组织中呈现逐渐下降的趋势,在恶性程度高的肿瘤组织中表达更高,usp39在鳞状细胞癌组中表达高于日光性角化病组,usp39、Ki67可能与皮肤恶性肿瘤的发生发展有一定相关。2.日光性角化病组织中usp39、Ki67的表达有自己的特点:趋向于在细胞异常增生的基底部组织中表达,表皮上层多为阴性。这与日光性角化病不典型的角质形成细胞出现于表皮下层的病理特点相符合,可初步考虑作为日光性角化病与鲍温病鉴别诊断参考线索之一。***39、Ki67强阳性表达多出现在畸形、分裂像明显、核大的细胞中,usp39、Ki67可促进细胞分裂、增殖,与细胞增殖活性、肿瘤恶性程度有关,usp39在侵袭性肿瘤组织中较原位癌、癌前期皮肤病组织中表达更高,正常组织中不表达,推测usp39对有丝分裂的促进作用更多程度上可能是病理性而非生理性的,与Ki67相比可能更具有侵袭性。4.在鳞状细胞癌组织中Ki67阳性表达与usp39阳性表达有一定相关性,usp39、Ki67对细胞周期进展可能有相互促进作用,两者同时高表达提示可能肿瘤侵袭性较高,当鲍温病、日光性角化组织中usp39及Ki67同时高表达,需警惕肿瘤侵袭性增加,从而可指导制定临床治疗方案。

关键词：皮肤鳞状细胞癌(CSCC) 鲍温病(Bowen) 日光性角化病(AK) Ki67 usp39 免疫组化

usp39通过调节FoxO1的表达促进肺癌细胞的增殖

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USP39通过调节FoxO1的表达促进肺癌细胞的增殖

作者：陈洁安徽医科大学

学位级别：硕士

背景肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,也是造成癌症死亡的主要原因,与大多数生存率稳步上升的肿瘤相比,肺癌的治疗现状仍不乐观,病情进展较迅速,其发病机制仍不明确。在众多肺癌靶分子中,泛素特异性蛋白酶39（ubiquitin-specific protea... 详细信息

背景肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,也是造成癌症死亡的主要原因,与大多数生存率稳步上升的肿瘤相比,肺癌的治疗现状仍不乐观,病情进展较迅速,其发病机制仍不明确。在众多肺癌靶分子中,泛素特异性蛋白酶39（ubiquitin-specific protease 39,usp39）作为一种促癌因子,参与调控肿瘤细胞的迁移、衰老、凋亡等过程,但其在肺癌中的作用及分子机制尚不明确。目的通过研究usp39在非小细胞肺癌中的表达,筛选、检测其下游信号分子的表达及功能,探究usp39及其下游靶基因FoxO1在非小细胞肺癌发生、发展的作用。方法利用免疫组化实验、内源性免疫荧光、Western blot等实验探究肺癌组织及细胞中usp39的表达水平、细胞中的亚细胞定位,通过慢病毒包装感染shRNA敲低、瞬时转染siRNA敲低实验,初步探究肺癌细胞A549中usp39、FoxO1的作用,了解usp39对肺癌细胞生长、增殖的影响,以及下游靶基因FoxO1在肺癌发生、发展的作用。结果在A549细胞系中,usp39主要定位于的细胞核中,FoxO1主要定位于细胞质中。usp39能促进肺癌细胞系A549的增殖能力,抑制FoxO1的表达会抑制A549的增殖,usp39可能通过调节FoxO1发挥促癌作用。结论usp39可能通过调节FoxO1在肺腺癌细胞中的表达促进肺癌的发生。

关键词： usp39 FoxO1 细胞增殖肺癌

usp39通过TRIM26/β-catenin调控肝癌细胞增殖和迁移的机制研究

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USP39通过TRIM26/β-catenin调控肝癌细胞增殖和迁移的机制研究

作者：雷永斌厦门大学

学位级别：硕士

2020年全球癌症报告中,肝癌发病率和死亡率都处于前列。在我国由于饮食习惯和乙肝病毒的影响,肝癌的发病率则处于第5位。临床上,HCC的系统治疗手段有限,且预后差。因此,肝癌的机制还需要更多的资料和数据阐明以指导临床上对肝癌的诊疗... 详细信息

2020年全球癌症报告中,肝癌发病率和死亡率都处于前列。在我国由于饮食习惯和乙肝病毒的影响,肝癌的发病率则处于第5位。临床上,HCC的系统治疗手段有限,且预后差。因此,肝癌的机制还需要更多的资料和数据阐明以指导临床上对肝癌的诊疗。泛素特异性蛋白酶39(usp39)属于去泛素化酶家族的一员,usp39存在两种不同角色,即去泛素化酶和RNA剪接相关因子。usp39在胶质瘤、肝细胞癌和结直肠癌等恶性肿瘤中高表达。usp39调控增殖、细胞周期和转移等肿瘤相关生物学过程。本论文以肝癌细胞为研究对象阐明了 usp39在促进肝癌进展过程中的作用机制。首先,在细胞生物学功能实验中,我们通过集落形成实验、MTT实验和划痕实验,证明了usp39通过Wnt通路促进HCC细胞的增殖和迁移。在usp39促进肝癌细胞增殖和迁移的机制研究方面,我们发现usp39的表达变化不改变β-catenin的mRNA水平,然而Western blot实验提示,β-catenin的蛋白变化具有统计学意义。通过IF实验、IP实验和pull down实验等,我们证实了 usp39结合β-catenin,并去泛素化β-catenin,以稳定β-catenin蛋白表达,同时增加下游c-myc和cyclinD1等的转录,从而促进肝癌进展。另外,在干扰usp39基因的RNA-seq数据中,我们发现过表达usp39使得TRIM26第四外显子处可变剪接事件发生显著变化。通过定量PCR实验我们证明了 usp39抑制TRIM26前体mRNA的剪接和成熟,从而减少TRIM26蛋白表达。在敲低TRIM26的细胞生物学功能实验中,通过MTT实验和Transwell实验等,我们证实了,敲低TRIM26促进肝癌细胞的增殖和迁移。当Wnt通路被抑制时,敲低TRIM26不能促进肝癌细胞的增殖和迁移。机制上,TRIM26作为E3泛素连接酶的一种,我们证明了 TRIM26结合β-catenin并泛素化降解β-catenin,减少核内β-catenin的蛋白水平以抑制下游癌基因c-myc和cyclinD 1的转录,从而抑制肝癌的发生发展。综上,我们的研究结果阐明了 usp39促进肝癌发生发展的两种不同途径。即usp39既可直接去泛素化β-catenin分子,从而促进肝癌进展;同时usp39抑制TRIM26前体mRNA的剪接和成熟过程,减少TRIM26蛋白表达,β-catenin泛素化降低,从而间接提高β-catenin蛋白水平。该研究描述了usp39在调控肝癌进展中的复杂性,有望为肝癌发病机制提供更多解释。

关键词：肝细胞癌 usp39 β-catenin RNA剪接泛素化

usp39、EZH2及Sox17在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

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中国现代医学杂志 2017年第11期27卷 54-58页

作者：戈瑶乐山职业技术学院病理研究室四川乐山614000

目的探讨usp39、EZH2和Sox17在乳腺癌组织中的表达及其临床意义。方法选取90例乳腺癌患者根据临床病理特征不同,分为原位癌34例、早期浸润癌41例和浸润癌15例。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定3组患者的肿瘤组织中usp39、EZH2和Sox... 详细信息

目的探讨usp39、EZH2和Sox17在乳腺癌组织中的表达及其临床意义。方法选取90例乳腺癌患者根据临床病理特征不同,分为原位癌34例、早期浸润癌41例和浸润癌15例。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定3组患者的肿瘤组织中usp39、EZH2和Sox17,microRNA自噬基因表达差异。结果浸润癌组患者的的肿瘤组织中usp39、EZH2信使核糖核酸(mRNA)表达量高于原位癌组及早期浸润癌组患者,Sox17 mRNA表达量低于原位癌组及早期浸润癌组患者;miR-29a、miR-149表达量高于原位癌组及早期浸润癌组患者,miR-125b、miR-21和miRNA-26a表达量低于原位癌组及早期浸润癌组患者;自噬基因LC3mRNA表达量高于原位癌组及早期浸润癌组患者,Beclin1、ATG2B和ATG4G mRNA表达量低于原位癌组及早期浸润癌组患者。乳腺癌患者肿瘤组织usp39、EZH2和Sox17 mRNA表达量与相关microRNA表达量、自噬基因表达量存在直接相关关系。结论乳腺癌组织中usp39、EZH2表达升高,Sox17表达量降低且与乳腺癌细胞的增殖、凋亡有关。

关键词：乳腺癌 usp39 EZH2 Sox17 自噬

usp39在卵巢癌顺铂化疗耐药中的表达情况及对细胞耐药性的影响

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USP39在卵巢癌顺铂化疗耐药中的表达情况及对细胞耐药性的影响

作者：王卓郑州大学

学位级别：硕士

背景及意义卵巢癌作为一种恶性程度极高的妇科肿瘤,预后不良,大多数患者就诊时已为晚期,并且70%左右的卵巢癌患者会在两年内肿瘤复发。目前,卵巢癌的主要治疗方法是以手术为基础,联合辅助化疗。随着卵巢癌腹腔镜手术及机器人辅助手术、... 详细信息

背景及意义卵巢癌作为一种恶性程度极高的妇科肿瘤,预后不良,大多数患者就诊时已为晚期,并且70%左右的卵巢癌患者会在两年内肿瘤复发。目前,卵巢癌的主要治疗方法是以手术为基础,联合辅助化疗。随着卵巢癌腹腔镜手术及机器人辅助手术、辅助化疗的改进,一定程度上改善了卵巢癌患者的围手术期效果及预后,但由于化疗药物的毒副反应及耐药性的存在,多数卵巢癌患者经过初始治疗后会出现化疗耐药、肿瘤复发、广泛转移等,甚至导致患者死亡。晚期卵巢癌5年生存率小于30%。几乎所有的患者都会产生原发性或获得性的化疗耐药,而发生化疗耐药的卵巢癌患者的治疗非常棘手,严重影响患者生存质量。因此,探索新的改善卵巢化疗敏感性的治疗方法,提高卵巢癌患者的无进展期和总生存期,已刻不容缓。泛素特异性蛋白酶39(ubiquitin specific peptidase 39,usp39)基因位于人染色体2p11.2,调节纺锤体组装检查点和有丝分裂,参与mRNA剪切及剪切小体的组成,在细胞有丝分裂中维持纺锤体检验点完整性,确保细胞成功有丝分裂,也参与了肿瘤的发生与发展。已有文献报道,卵巢癌的发生、发展与usp2、usp7、usp14等有密切关系。Liu S等发现usp39抑制乳腺癌细胞的凋亡,促进乳腺癌的发生、侵袭、转移,影响乳腺癌患者预后。也有文献报道,usp39与肝癌、甲状腺髓样癌、口腔鳞状细胞癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌、胃癌、食管癌的增殖和凋亡有关。本课题组前期研究发现,usp39基因在卵巢癌组织中表达升高,体内及体外实验中发现,usp39可促进卵巢癌细胞增殖、侵袭、转移,并抑制细胞凋亡。usp39基因参与该过程可能是通过调控Aurora B基因的表达,影响PI3K/AKT信号通路活性实现的。然而,usp39是否参与卵巢癌顺铂化疗耐药目前还无相关研究,卵巢癌顺铂化疗耐药细胞中usp39是否高表达、沉默usp39表达是否可改善卵巢癌化疗耐药等问题仍然不是很清楚。本研究旨在为改善卵巢癌患者顺铂化疗耐药提供一个新的思路。目的检测usp39基因在顺铂耐药细胞株OVCAR-3/DDP及其亲本敏感细胞株OVCAR-3中的表达差异,usp39-siRNA转染OVCAR-3/DDP细胞沉默usp39基因表达,分析usp39基因沉默后卵巢癌细胞增殖及对顺铂化疗敏感性的变化,为临床上逆转卵巢癌化疗耐药提供一个新的思路。方法1、应用反转录聚合酶链式反应和蛋白印迹方法检测usp39 mRNA和蛋白在OVCAR-3/DDP及OVCAR-3细胞中的表达情况。2、usp39-siRNA转染OVCAR-3/DDP细胞,反转录聚合酶链式反应和蛋白印迹方法检测转染后细胞中usp39基因的表达量。3、CCK-8法检测转染细胞的增殖情况及对顺铂化疗耐药性的变化。结果1、usp39在OVCAR-3/DDP细胞中mRNA的相对表达量是OVCAR-3细胞的(2.69±0.62)倍,蛋白表达量是OVCAR-3细胞的(2.21±0.53)倍,差异均有统计学意义(Pusp39在卵巢癌顺铂化疗耐药细胞株OVCAR-3/DDP中的表达显著高于亲本细胞株OVCAR-3中的表达。2、usp39-siRNA转染OVCAR-3/DDP细胞后,以对照组(未转染组)OVCAR-3/DDP细胞内usp39的mRNA和蛋白水平为100%,usp39在实验组(usp39-siRNA转染组)OVCAR-3/DDP-usp39-siRNA细胞中的mRNA表达水平为(19.28±2.92)%,蛋白表达水平为(18.25±2.81)%,与OVCAR-3/DDP细胞组相比,差异均有统计学意义(Pusp39在空白组(usp39对照序列转染组)OVCAR-3/DDP-usp39-NC细胞中的mRNA表达水平为(102.07±3.73)%,蛋白表达水平为(99.14±1.29)%,与OVCAR-3/DDP细胞组相比,无显著差异(P>0.05)。3、三组细胞分别和顺铂共同孵育24h、48h、72h后,与对照组OVCAR-3/DDP细胞及空白组OVCAR-3/DDP-usp39-NC细胞相比较,实验组OVCAR-3/DDP-usp39-siRNA细胞增殖速度明显降低、对顺铂的抑制率明显升高;与不同浓度的顺铂共同孵育后,空白组OVCAR-3/DDP-usp39-NC细胞(IC50=(182.09±20.17)μmol/L)与对照组OVCAR-3/DDP细胞(IC50=(191.33±32.53)μmol/L)相比,差异无统计学意义(P>0.05),与实验组OVCAR-3/DDP-usp39-siRNA细胞组顺铂的IC50值为(47.24±3.17)μmol/L,,差异均有统计学意义(Pusp39基因在OVCAR-

关键词： usp39 卵巢癌顺铂化疗耐药

usp39调控VEGF-A可变剪切促进肾癌恶性增殖和血管形成的作用及机制研究

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USP39调控VEGF-A可变剪切促进肾癌恶性增殖和血管形成的作用及机...

作者：徐达中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

背景和目的肾细胞癌(RCC)是泌尿生殖系统的常见肿瘤,其发病率仅次于前列腺癌,是肾癌中最常见的类型。近年来,随着临床检测水平的进步,影像学技术的发展,越来越多肾癌患者在早期即被发现,并得到及时的手术治疗,但是仍有三分之一的患者初... 详细信息

背景和目的肾细胞癌(RCC)是泌尿生殖系统的常见肿瘤,其发病率仅次于前列腺癌,是肾癌中最常见的类型。近年来,随着临床检测水平的进步,影像学技术的发展,越来越多肾癌患者在早期即被发现,并得到及时的手术治疗,但是仍有三分之一的患者初次诊断时已发生远处转移,失去根治性手术的机会。晚期肾癌对放疗、化疗、干扰素等治疗敏感性较差,患者的预后一直没有明显改善,靶向药物的问世,给晚期肾癌患者的治疗带来了希望,明显提高了患者的生存率,延长了生存时间,但是大部分患者在用药1年左右后会发生靶向耐药,且发生靶向耐药的患者病程进展快,预后差,因此探索肾细胞癌发生发展的分子机制,寻找肾细胞癌治疗的新靶点,进而提高晚期肾细胞癌患者的生存预后,成为泌尿外科临床医生亟需解决的难题。usp39即泛素特异性多肽酶39,其虽在结构上类似于去泛素化酶,但是并不具备去泛素化酶活性,它是剪接体小核糖核蛋白(sn RNP)装配过程中必不可少的分子,在pre-m RNA成熟过程中起重要作用,参与调控多种功能基因前体m RNA成熟。在骨肉瘤和黑色素瘤细胞中,敲减usp39能够抑制肿瘤细胞的有丝分裂和生长,在前列腺癌中,usp39能够促进肿瘤细胞的恶性增殖,提示usp39是一种重要的原癌基因。我们利用慢病毒载体在人源性293T细胞中过表达usp39后进行免疫共沉淀联合质谱分析,筛选出usp39相互作用蛋白丝苏氨酸剪接因子1(SRSF1)和丝苏氨酸蛋白激酶1(SRPK1),文献报道,SPRK1直接作用于SRSF1促进血管内皮生长因子-A(VEGF-A)剪切形成VEGF-A和VEGF-A剪切异构体形成,前者促进血管形成,后者抑制血管形成,在肿瘤的发生发展过程中起重要作用,但是其相互作用机制及在肾细胞癌中的功能作用尚不清楚,因此我们旨在探索usp39通过调节VEGF-A可变剪切促进肾细胞癌恶性增殖及血管形成的作用及机制。方法(一)、基因数据库中探索usp39在肾细胞癌中的表达水平及其与患者生存预后的关系通过ONCOMINE基因数据库分析usp39在肾细胞癌组织和癌旁组织中的表达水平,并分析其表达水平与肾细胞癌患者临床特征的相关性。(二)、构建稳定敲减usp39的肾癌细胞株并进行细胞增殖能力和细胞周期检测我们采用和元生物公司制备的敲减usp39(Lv-sh usp39)及空白对照(Lv-sh Con)慢病毒进行786-O及ACHN细胞感染,并通过绿色荧光验证感染效率,通过Western Blot和Real-time PCR验证usp39敲减效率。对稳定敲减usp39的细胞株及对照细胞株进行MTT实验、克隆形成实验和细胞周期检测,检测细胞增殖能力。(三)、检测稳定敲减usp39的血管内皮细胞HUVEC血管形成能力在稳定敲减usp39的基础上,通过小管形成实验,检测HUVEC细胞的血管形成情况。(四)、探索usp39与SRSF1和SRPK1相互作用的分子机制利用慢病毒载体在人源性293T工具细胞中过表达usp39后进行免疫共沉淀串联质谱分析,明确usp39与SRSF1和SRPK1相互作用,并通过构建usp39短截突变体与SRSF1及SRPK1质粒共转染,明确usp39与SRSF1和SRPK1的相互作用。(五)探索敲减及过表达usp39后对VEGF-A可变剪切体表达水平的影响在786-O细胞株中敲减及过表达usp39后,利用Western-Blot检测VEGF-A表达情况。结果(一)、利用ONCOMINE数据库对肾癌与正常肾组织中m RNA表达水平及其与临床特征相关性进行分析通过ONCOMINE数据库荟萃分析,usp39的m RNA表达水平在透明细胞肾细胞癌中显著高于癌旁组织,且其表达高低与患者生存率呈负相关,是肾癌患者生存率的独立危险因素。(二)、敲减usp39显著抑制肾癌细胞系增殖及克隆形成能力并诱导细胞周期停滞肾癌细胞系在稳定敲减usp39后,生长曲线较对照组显著受抑制,且敲减后的细胞系克隆数量较对照组明显减少(Pusp39可相应抑制或促进血管内皮细胞小管形成能力HUVEC细胞敲减及过表达usp39后进行小管形成实验,过表达usp39后HUVEC细胞形成小管数量及分支明显增加,敲减usp39后小管数量及分支明显减少。(四)、usp39(101-565)片段通过与SRSF1及SRPK1直接结合而发挥生物学作用通过免疫共沉淀串联质谱分析检测到usp39与SRSF1及SRPK1相互作用,通过usp39短截突变体与SRSF1及SRPK1质粒共转染,发现usp39通过(101-565)片段与SRSF1及SRPK1结合并促进SRPK1磷酸化SRSF1而发挥生物学作用。(五)、敲减及过表达usp39可分别上调和下调VEGF-A的表

关键词：肾细胞癌 usp39 VEGF-A可变剪切 SRPK1 SRSF1

usp39激活usp4增强TGF-β信号通路活性的分子机制研究

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USP39激活USP4增强TGF-β信号通路活性的分子机制研究

作者：曾响青岛大学

学位级别：硕士

研究目的:验证usp4与TGFβRI能否发生相互作用;检测usp4对TGFβRI的泛素化修饰;检测TGF-β信号通路活化后EMT标志分子的变化;探讨usp4蛋白表达对乳腺癌细胞生物学活性的影响;探讨usp39蛋白表达对乳腺癌细胞生物学活性的影响。研究方法:... 详细信息

研究目的:验证usp4与TGFβRI能否发生相互作用;检测usp4对TGFβRI的泛素化修饰;检测TGF-β信号通路活化后EMT标志分子的变化;探讨usp4蛋白表达对乳腺癌细胞生物学活性的影响;探讨usp39蛋白表达对乳腺癌细胞生物学活性的影响。研究方法:通过免疫共沉淀实验探究usp4与TGFβRI在细胞内的相互作用。通过重组慢病毒感染,构建稳定过表达usp4、稳定干扰usp4的乳腺癌细胞系。通过泛素化实验检测过表达usp4及干扰usp4对TGFβRI泛素化水平的影响。通过Western blot检测TGF-β信号通路活化后乳腺癌细胞EMT标志分子的表达量变化。通过划痕实验、细胞克隆形成实验、CCK-8实验探究过表达usp4对乳腺癌细胞生物学活性的影响。通过划痕实验、细胞克隆形成实验、CCK-8实验探究在过表达usp4的基础上再过表达usp39对乳腺癌细胞生物学活性的影响。实验结果:在BT-549细胞中过表达带有Flag标签的usp4,进行CO-IP实验证实TGFβRI和usp4发生了免疫共沉淀,二者可以在体内发生相互作用。经重组慢病毒感染成功构建稳定过表达usp4、稳定干扰usp4的乳腺癌BT-549细胞系。经荧光定量PCR和Western blot检验,稳定过表达usp4的BT-549细胞系中usp4 mRNA的表达量是对照细胞的14.22倍,蛋白的表达量是对照细胞的4.99倍;稳定干扰usp4的BT-549细胞系中usp4 mRNA的干扰效率可达82%,usp4蛋白的表达量也明显低于对照细胞。在乳腺癌BT-549细胞中,usp4可以对TGFβRI的进行泛素化修饰。过表达usp4可以使TGFβRI的泛素化水平降低,干扰usp4可以使TGFβRI的泛素化水平提高。使用TGFβ1诱导过表达usp4的BT-549细胞和空白对照BT-549细胞,两种细胞均可发生EMT的形态转变,且过表达usp4的BT-549细胞的EMT变化趋势更明显。经诱导后,间充质表型标志蛋白N-cadherin、β-catenin、Vimentin、Slug蛋白表达均上调,上皮表型标志蛋白ZO-1蛋白表达量下调,且过表达usp4的BT-549细胞EMT标记分子的蛋白表达量变化更明显。稳定过表达usp4的BT-549细胞的迁移能力、克隆形成能力、增殖能力均强于对照病毒感染的BT-549细胞和空白对照BT-549细胞,且差异具有统计学意义。在过表达usp4基础上再过表达usp39的BT-549细胞的迁移能力、克隆形成能力、增殖能力均强于只过表达usp4和空白对照BT-549细胞,且差异具有统计学意义。结论:TGFβRI和usp4可以在体内发生相互作用。在乳腺癌BT-549细胞中,usp4可以对TGFβRI的进行泛素化修饰。过表达usp4可使TGFβRI的泛素化水平降低,干扰usp4可使TGFβRI的泛素化水平提高。TGFβ1诱导可激活BT-549细胞的TGF-β信号通路,过表达usp4可进一步增强TGF-β信号通路活性,促进乳腺癌细胞发生EMT。过表达usp4可以增强乳腺癌BT-549细胞的生物学活性。在过表达usp4基础上再过表达usp39可进一步增强乳腺癌BT-549细胞的的生物学活性。

关键词：乳腺癌泛素化 usp4 usp39 TGFβRI